徐文思，張夢媛，李柏花，楊祺福,*，危納強，楊品紅，周順祥

（1.湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，湖南常德 415000；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000；3.環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南常德 415000；4.順祥食品有限公司，湖南益陽 413200）

蝦，屬甲殼類節(jié)肢動物，是重要的經(jīng)濟型水產(chǎn)品之一，其含有豐富蝦青素、維生素，是一種高蛋白低脂肪食品，廣受消費者喜愛。我國是蝦養(yǎng)殖大國，2019 年全球蝦的總產(chǎn)量約470 萬噸，中國蝦類總產(chǎn)量則達到110 萬噸，約為世界總產(chǎn)量的四分之一[1]。而蝦類在加工過程中，全蝦的利用率只有約50%。目前，蝦的加工副產(chǎn)物僅有極少部分被加工成飼料，其余絕大部分當作廢棄物處理，進而造成了環(huán)境污染和資源浪費。然而，蝦副產(chǎn)物中的甲殼素、殼多糖等物質(zhì)，能降低膽固醇、抑制癌細胞生長轉(zhuǎn)移，對防治心、血管疾病，降低血壓、強化肝臟功能具有良好功效[2?3]。蝦副產(chǎn)物中同樣富含蛋白質(zhì)，且氨基酸種類全面，包含了人體所需的8 種必需氨基酸、4 種呈味氨基酸，其中淡水蝦頭、殼粗蛋白中必需氨基酸占45.33%，與牛奶中必需氨基酸（46.59%）和酪蛋白中必需氨基酸（46.14%）極為接近，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源[4?5]。目前國內(nèi)外主要以克氏原螯蝦、麻蝦、錦州對蝦等淡水蝦以及南美白對蝦、南極磷蝦、蝦蛄、紅蝦等海蝦的副產(chǎn)物為原料，提取制備蛋白及活性多肽，進而提高蝦副產(chǎn)物的高效加工利用。

1 蛋白及多肽提取方法

針對于蛋白質(zhì)的特性，常見的蛋白提取技術(shù)有堿提法、堿溶酸沉法、鹽溶法等。

1.1 堿液提取法

堿液提取法是較為傳統(tǒng)的蛋白提取方法。稀堿溶液可進入細胞內(nèi)部，所以絕大多數(shù)蛋白質(zhì)易溶于稀堿溶液，蛋白質(zhì)在堿的催化作用下發(fā)生肽鍵斷裂[6?7]。又因為蛋白質(zhì)是兩性化合物，在一定的堿性環(huán)境中，蛋白質(zhì)以離子形式溶解于堿性溶液里，進而提取細胞中的蛋白質(zhì)[8?9]。胡云虎等[9]確定了堿溶液法提取克氏原螯蝦副產(chǎn)物蛋白的最佳條件：利用10%氫氧化鈉溶液在100 ℃條件下反應4 h，此時提取出蛋白質(zhì)的純度為77.38%。陳博等[10]同樣利用了堿法并加以超聲波輔助來提取錦州對蝦副產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)，在溫度50 ℃、氫氧化鈉質(zhì)量分數(shù)10%的條件下超聲波輔助提取30 min，蛋白提取率為14.16%。堿液提取法操作簡單，成本低廉，但是其對環(huán)境污染較大，在提取時不僅水解程度難以控制，而且提取出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也會受到不同程度的破壞[1]。

1.2 堿溶酸沉提取法

堿溶酸沉提取法，是利用蛋白質(zhì)在堿性溶液中溶解，再用酸液將蛋白質(zhì)提取液中的pH 調(diào)至蛋白質(zhì)的等電點，使蛋白沉淀析出，最后分離清洗，調(diào)回pH，得到蛋白。南極磷蝦中蛋白的溶解最適條件為pH11.5 和4 ℃，此條件下經(jīng)過兩次堿溶，每次30 min，蛋白質(zhì)的溶出率為97.23%；酸沉的最適pH4.6，在酸沉的同時加入適量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，能夠有效提高蛋白質(zhì)的得率，最終蛋白質(zhì)得率為52.68%[11]。堿溶酸沉法提取蝦及其副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)，是目前實驗室內(nèi)最常用的一種提取方法，工藝方法成熟，但在工業(yè)生產(chǎn)中會收容大量的酸和堿，有一定的危險性，對環(huán)境也會造成一定影響。

1.3 鹽溶液提取法

鹽溶液提取法也可稱為鹽析法，也是一種蛋白質(zhì)提取技術(shù)。在中性的鹽溶液中，蛋白質(zhì)分子表面的電荷增加，能夠增強蛋白質(zhì)分子與水分子之間的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大。通過鹽溶液法優(yōu)化提取蝦蛄中的鹽溶蛋白：在提取液pH6.36、NaCl 濃度0.11 mol/L、料液比1:3（v:w）、攪拌24 min 后，提得蛋白質(zhì)含量達22.46 mg/g[12]。此法雖簡單，無危害性溶劑，但是提純率較低，且要對所提取的蛋白要進一步脫鹽純化。

目前蛋白質(zhì)與多肽的界定并不明確，一般來說，肽鏈中含有100 個氨基酸殘基時，即為蛋白質(zhì)。在提取蛋白后，可以切斷肽鍵來獲得不同分子量的多肽、寡肽等。

1.4 酶解法

酶解法是一項環(huán)境友好型蛋白及多肽的綠色提取技術(shù)。在適宜的溫度和pH 條件下，具有一定活性的蛋白酶存在某些特異性的催化位點，這些位點可以催化底物中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的肽鍵發(fā)生水解，使高分子量的蛋白質(zhì)斷裂成低分子量的多肽。蛋白酶在水解蛋白質(zhì)的同時，也水解掉與蛋白質(zhì)相連的物質(zhì)，能有效提高蛋白質(zhì)的提取率[8,13]。

1.4.1 單酶提取 無論是海水中的紅蝦還是淡水克氏原螯蝦，以其加工后的副產(chǎn)物為原料，都能在堿性蛋白酶的催化下水解，其蛋白質(zhì)提取率分別為68.76%、45.76%[14?15]。Baek 等[16]研究計算發(fā)現(xiàn)，較中性蛋白酶而言，加入0.3%的堿性蛋白酶2.5 h 后可以得到最高的蛋白水解產(chǎn)物。

1.4.2 雙酶提取 除單一酶水解，可以使用復合酶，效果加倍。以克氏原螯蝦副產(chǎn)物為原料，王燕等[17]使用木瓜蛋白酶與風味蛋白酶按1:1.5 混合作為復合蛋白酶，蛋白酶用量為1.0%，料液比1:10，在pH6.5、50 ℃、3 h 條件下蛋白質(zhì)提取率為54.22%；胡川[18]先以單一的堿性蛋白酶或胃蛋白酶在各自的最優(yōu)條件下分別對蝦副產(chǎn)物進行水解，蛋白提取率分別能達到61.9%和53.9%；然后通過雙酶協(xié)同工藝：堿性蛋白酶酶解3 h（溫度40 ℃、pH7.5、酶加量0.3%）、胃蛋白酶酶解1 h（溫度40 ℃、pH3.0、酶加量0.2%），蛋白提取率倍增至86.1%，比單酶法效果更明顯。復合酶的酶切位點選擇性更多，有利于蛋白的水解。

酶解法提取蛋白質(zhì)，過程簡單，操作容易，反應條件溫和，而且堿性蛋白酶處理不會對原料的殼聚糖回收率和質(zhì)量產(chǎn)生影響[19]。但因其成本過高，目前還不利于大批量生產(chǎn)，而且水解過程易腐敗，因此還需進一步針對規(guī)模性工業(yè)化生產(chǎn)進行探究[20]。

1.5 超聲波輔助酶提取法

超聲波輔助酶提取法是伴隨以上幾種方法而產(chǎn)生的提取方法。超聲波的主要作用是利用其空化效應、熱效應、化學效應、生物效應等對細胞的細胞壁和細胞膜進行物理破碎，增大物質(zhì)分子的運動頻率和速度，加速堿液的擴散，從而加速蛋白質(zhì)的溶解速率，最終提高蛋白質(zhì)的提取率[2,8]。通過超聲波輔助木瓜蛋白酶提取南美白對蝦副產(chǎn)物中的蛋白：在超聲功率120 W 下處理20 min 后，并在pH7.5、木瓜蛋白酶添加量8000 U/g，60 ℃酶解3 h，最終蛋白水解度達65.25%[21]。同樣，超聲波也可以輔助雙酶來提取南美白對蝦副產(chǎn)物中的蛋白。pH7.5，180 W 條件下超聲30 min，1%的堿性蛋白酶和0.1%的中性蛋白酶混合提取，酶解溫度50 ℃，酶解3 h，蛋白水解度最高為42.5%[22]。通過超聲波的機械震蕩以及酶的催化作用可以提高蛋白質(zhì)的提取率，同時也會增加一定的成本消耗。

1.6 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵，就是利用微生物自身的代謝作用，改變蛋白質(zhì)本身的品質(zhì)，產(chǎn)生易于消化的短肽、氨基酸等物質(zhì)，使廢棄物變成高附加值的發(fā)酵產(chǎn)品[1,20]。Bhaskar 等[23]用乳酸片球菌發(fā)酵蝦副產(chǎn)物，在pH4.3、5%接種量、37 ℃、添加15%的葡萄糖，發(fā)酵3 d后，蛋白回收率為97.9%。國內(nèi)學者用3 株乳酸菌混合的發(fā)酵劑發(fā)酵蝦副產(chǎn)物，在加入20%葡萄糖、1:2固液比、10%接種量的條件下，維持溫度39 ℃發(fā)酵5 d，蛋白回收率可達到94.0%[24]。微生物發(fā)酵法提取蛋白及多肽是蛋白回收率最高的一種提取方法，同時也存在微生物發(fā)酵條件嚴苛，不易控制的弊端。

總體而言，對于蝦加工副產(chǎn)物中蛋白及多肽的提取，酶解法和微生物發(fā)酵法更有發(fā)展前景，同時也可在兩種方法的基礎(chǔ)上輔以超聲波、微波等技術(shù)，提高蝦副產(chǎn)物中的蛋白及多肽的回收率。

2 蝦加工副產(chǎn)物多肽的生物活性

蛋白質(zhì)是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多肽鏈經(jīng)過盤曲折疊形成的，肽分子量小于蛋白質(zhì)，因而容易被小腸直接吸收并進入人體發(fā)揮功效作用；雖然單個氨基酸不具有活性，但是由幾個到幾十個氨基酸殘基以酰胺鍵構(gòu)成的多肽具有不同功能特性，生物活性肽也稱為功能性肽?；钚噪目梢赃M入細胞參與機體各種重要生理功能的調(diào)節(jié)，預防和治療疾病[25?26]。來自蝦類及其副產(chǎn)物中的食源活性肽具有降血壓[27]、抗菌[28]以及抗氧化損傷等作用[29]。

2.1 抗氧化肽

氧化與人類及其他動物的許多疾病，如癌癥、老化、風濕性關(guān)節(jié)炎、動脈硬化等的發(fā)病機理有關(guān)。人體可通過適當攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)，降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過氧化，幫助機體抵御疾病[30]。

2.1.1 抗氧化肽分類 抗氧化肽主要由2～16 個氨基酸組成，大量存在于動物和植物體內(nèi)。目前抗氧化肽主要分三類：天然存在的、通過酶解等方法獲取以及人工化學合成的[15]。天然存在的抗氧化肽，是指存在于動植物體內(nèi)的一些小分子活性肽，比如谷胱甘肽、肌肽、蛇肉肽等。蛋白酶酶解是當前獲得抗氧化肽的主要手段之一，通過酶解使蘊含在母蛋白質(zhì)中的抗氧化肽釋放出來，而且酶解法條件溫和、安全可控，能夠較大程度保證肽的活性。人工合成的抗氧化肽有著氨基酸序列明確、高度富集的特點，而且人工合成可以彌補酶解法中多肽難以富集的缺陷[31]。

2.1.2 抗氧化肽作用機制 抗氧化肽的機理主要有兩方面：一是直接途徑，直接清除自由基或者抑制自由基的產(chǎn)生；作為供氫體或供電子體與自由基結(jié)合以清除自由基，其抗氧化活性與多肽分子的大小及氨基酸分子的組成、排列順序有關(guān)，大多數(shù)抗氧化活性強的肽分子量小于3000 Da。二是間接途徑，作用于抗氧化酶，加強抗氧化酶對自由基的清除能力或抑制氧化酶的活性；抗氧化肽提高抗氧化酶活性主要通過四個方面，第一，直接清除自由基，減少自由基對抗氧化酶的損傷；第二，加強抗氧化酶的表達，促進抗氧化酶的產(chǎn)生；第三，對受損的抗氧化酶進行修復，恢復其抗氧化活性；第四，抑制氧化酶的表達，減少自由基的產(chǎn)生[32?34]。

2.1.3 抗氧化肽制備 以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率為篩選指標，分別以麻蝦、南極磷蝦、克氏原螯蝦副產(chǎn)物為原料，測得木瓜蛋白酶酶解出的多肽抗氧化性最好，DPPH 自由基清除率的結(jié)果分別為81.6%、74.33%、94%[35?37]。利用木瓜蛋白酶酶解南美白對蝦副產(chǎn)物，制備的抗氧化多肽的羥自由基的清除率為67.89%[38]；而克氏原螯蝦副產(chǎn)物在堿性蛋白酶條件下制備的多肽，其抗氧化能力最強，羥自由基清除率在74.66%～85.87%[39?40]；在酶解法條件的基礎(chǔ)上加入葡萄糖后發(fā)生美拉德反應，克氏原螯蝦副產(chǎn)物蛋白肽在美拉德反應過后抗氧化活性明顯增強，其還原力、羥自由基清除能力，DPPH 清除能力分別為未加葡萄糖反應前的8.367、1.829 倍和2.027 倍[41]。過程復雜的美拉德反應在改變食物風味和色澤的同時也會產(chǎn)生大量的抗氧化性物質(zhì)[42]。

2.2 ACE 抑制肽

心血管疾病是世界十大死亡原因中的頭號殺手。中國心血管疾病患者約2.9 億，患病人數(shù)還在不斷上升，其中高血壓疾病患者占比最大，而且逐漸趨于年輕化[43]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，食源性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）抑制肽對抗高血壓具有明顯效果，而且ACE 抑制肽來源廣泛、安全性高、副作用小，是治療高血壓的理想藥物。

2.2.1 ACE 抑制肽來源 ACE 抑制肽主要有三大來源，一種是植物性來源，植物性來源的ACE 抑制肽來源豐富、分離純化方便、成本低。而且，谷物和堅果的蛋白質(zhì)水解液中有著更為豐富的ACE 抑制肽[44]。另一種是動物性來源，動物來源ACE 抑制肽主要以家畜、海洋生物和蛋類來源為主[45]。最后，ACE抑制肽也可由益生菌菌株發(fā)酵的乳制品產(chǎn)生。由于許多乳品發(fā)酵劑培養(yǎng)物的高度蛋白水解性質(zhì)，在發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)過程中可以預期形成生物活性肽[44]。

2.2.2 ACE 抑制肽作用機制 生物體內(nèi)，腎素將血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ（AngⅠ），接著血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，再將AngⅠ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），引起血管收縮，同時引起醛固酮的釋放，并作用于遠曲小管和集合管，使其增加對Na+和水的吸收，引起血壓升高。在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，激肽釋放酶能夠?qū)⒓る脑D(zhuǎn)化為激肽，而ACE 則可以將激肽轉(zhuǎn)化為無活性片段使血管收縮、血壓升高，而ACE 抑制肽能夠?qū)⑿纬傻募る霓D(zhuǎn)變成緩激肽進而降低血壓[46]。

2.2.3 ACE 抑制肽制備 吳秉宇等[47]用兩步酶解法提取ACE 抑制肽，用羧肽酶A、B 兩步酶解南美白對蝦副產(chǎn)物所得水解液的半抑制濃度為6.39 mg/mL，經(jīng)透析和凝膠層析后得到了4 個IC50值小于0.2 mg/mL的組分，其中IC50最低為0.134 mg/mL，顯示了較高的ACE 抑制活性。這也表明羧肽酶A/B 酶解可制備出高活性ACE 抑制肽。蔣長興等[48]用胃蛋白酶水解小龍蝦蝦頭制備ACE 抑制肽，在pH2.4，溫度40.85 ℃，底物濃度10.05%，酶-底物質(zhì)量比6.97，水解4.5 h 時ACE 抑制率可達到80.9%。付雪艷等[49]發(fā)現(xiàn)堿性酶解制備的中國毛蝦多肽的降壓作用及抑制ACE 生成的作用均強于中性酶解多肽，其中200 μg/g的多肽降壓效果最好，相當于14 μg/g 的ACE 抑制劑卡托普利。毛蝦ACE 抑制肽無論是長期預防給藥還是急性治療給藥對腎性高血壓大鼠均有顯著的降壓作用，抑制AngⅡ的生成可能是其降壓機制之一。

2.3 抗菌肽

抗菌肽廣泛存在于自然界生物體內(nèi)，是一類小分子多肽物質(zhì)，同時也是固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有較好抑制或殺傷作用。而且，抗菌肽具有無污染、無殘留、廣譜抗菌和不易產(chǎn)生耐藥性的特點，且對癌細胞也具有一定的治療功能，有望取代抗生素成為新的抗菌劑[50]。

2.3.1 抗菌肽分類 抗菌肽根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為三類，一類是α-螺旋（α-helica）型抗菌肽，其在水溶液中是無序的，但只要與生物膜接觸，α-螺旋結(jié)構(gòu)就會呈現(xiàn)兩親性。第二類是β-折疊（β-sheet）型抗菌肽，其種類最多，廣泛存在于海洋無脊椎動物、植物、兩棲類體內(nèi)。β-折疊型抗菌肽在水溶液中排列有序，并含有保守的半胱氨酸殘基，形成二硫鍵，增強結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減少蛋白質(zhì)降解。最后一種是延伸環(huán)狀抗菌肽，組成延伸環(huán)狀抗菌肽的是高比例特定的氨基酸殘基。延伸環(huán)狀抗菌肽不能折疊成二級結(jié)構(gòu)，而且許多延伸環(huán)狀抗菌肽不具備酶活性[51]。

2.3.2 抗菌肽作用機制 通過靜電作用，帶正電荷的抗菌肽與帶負電荷的細菌表面結(jié)合，然后，再與脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生作用進入細胞內(nèi)部。而且，當抗菌肽以垂直方式進入膜內(nèi)時，肽脂比值偏高，當抗菌肽和細胞膜平衡，橫跨膜孔時，肽脂比值偏低。目前活性肽作用于膜的機制主要有四種假說，第一種是桶型模型，抗菌肽分子附著在細胞膜表面，垂直插入膜內(nèi)，形成膜孔，導致內(nèi)外膜之間電勢失衡；第二種是環(huán)形模型，與夾層磷脂分子親水頭部結(jié)合的抗菌肽分子垂直插入細胞膜內(nèi)，形成較大的跨膜孔徑，讓抗菌肽分子進入細胞內(nèi)部；第三種是地毯模型，在靜電作用下，抗菌肽分子與膜平衡排列，干擾脂質(zhì)雙分子層，最終形成孔徑，便于抗菌肽分子進入細胞內(nèi)部；第四種是聚合模型，在靜電作用下，抗菌肽分子與磷脂雙分子層相互作用，形成大小不同形狀不一的孔徑，以便抗菌肽進入細胞[52?53]。

2.3.3 抗菌肽制備 中性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶酶解南極磷蝦，最終制得分子量在254～709 Da 之間的混合肽，對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制生長效果，最低抑菌濃度為5 mg/mL[54]。除使用酶法外，酸液法提取南極大磷蝦抗菌肽的條件為稀硫酸濃度0.28 mol/L，稀硫酸用量3.0 倍，乙醇用量2.0 倍，抗菌肽得率為1.21%[55]。關(guān)于蝦加工副產(chǎn)物中抗菌肽提制的研究，能夠為飼料用抗生素替代品的開發(fā)提供初步的參考。

2.4 其他活性

通過胰蛋白酶水解、超濾、凝膠層析、高效液相色譜等技術(shù)對海洋生物蝦蛄軟體組織中的活性多肽進行分離與純化，此肽具有一定的抑制腫瘤細胞凋亡和免疫活性，對小鼠巨噬細胞的吞噬能力表現(xiàn)出一定的促進作用[56?57]。蝦加工后的副產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶水解得到的多肽與氯化鈣反應制備的鈣肽結(jié)合物，其紫外、紅外光譜均表明鈣與肽之間形成了新的化學鍵[2]。多肽也可以與Zn2+螯合后作為營養(yǎng)補鋅劑使用，既能攝入必需氨基酸，又能促進鋅元素的吸收，制得的螯合鋅分子內(nèi)Zn2+與多肽中的N 形成配位鍵，與多肽的-COOH 形成離子鍵，使得螯合鋅以內(nèi)鹽的形式存在，理化性質(zhì)穩(wěn)定[58]。多肽與金屬離子螯合有利于提高金屬礦物質(zhì)的生物學效價，有良好的營養(yǎng)補充、抗菌、抗氧化以及提高機體免疫力的效果[59]。目前在制備水產(chǎn)生物活性肽方面，多使用蛋白酶水解法，雖然安全環(huán)保，但酶解的程度不易控制，酶的使用成本也相對較高，可以考慮結(jié)合固定化酶技術(shù)進行活性肽的提制。

3 前景與展望

蝦副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)、蝦青素等營養(yǎng)成分，對這些廉價且可利用資源進行開發(fā)利用，具有良好的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。副產(chǎn)物蛋白及活性多肽的提取，多以傳統(tǒng)的酸堿提取法為主，其需要大量的化學試劑，因此對生態(tài)環(huán)境造成影響，同時伴有一定的安全隱患。通過總結(jié)對比分析發(fā)現(xiàn)，酶解法和微生物發(fā)酵法具有更好的應用前景。從蝦副產(chǎn)物中制備出的活性多肽具有抗氧化、抗菌、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、螯合金屬等生物活性，可見由蝦副產(chǎn)物提取的活性多肽在健康食品開發(fā)、人類慢性疾病治療方面有著巨大的應用潛力。目前，以蝦副產(chǎn)物為原料提取蛋白肽的工藝及技術(shù)還停留在實驗室驗證階段，而對于規(guī)模性的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)集成及應用尚需完善。此外，蝦加工副產(chǎn)物活性肽的結(jié)構(gòu)序列、活性機理還有待深入研究與揭示。