唐柯，張小倩，李記明，姜文廣，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

冰葡萄酒是一種特殊的甜型葡萄酒，因其濃郁的香氣特征及獨特的口感，被譽為葡萄酒中的“液體黃金”[1]。香氣是決定冰葡萄酒質(zhì)量的一個重要指標，也是當(dāng)下冰葡萄酒研究的熱點[2-3]。冰酒的香氣受產(chǎn)地、品種、釀造工藝等多種因素影響。釀造工藝對冰酒香氣的影響，主要集中在酵母和發(fā)酵溫度上[4-5]。

目前在釀酒酵母對冰葡萄酒香氣特征性的影響方面已有較多研究，但主要還是以國外研究為主。ERASMUS等[6]比較了7種商業(yè)酵母菌株在冰酒釀造中的差異，結(jié)果表明ST、N96和EC1118最適宜冰酒生產(chǎn)。CRANDLES等[7]通過對不同酵母(V1116、VL1、EC1118、自然發(fā)酵)發(fā)酵冰酒香氣化合物研究發(fā)現(xiàn)，在雷司令冰酒中，EC1118產(chǎn)生的2-甲基-1-丁醇和乙酸異戊酯和癸酸乙酯濃度最高；在威代爾酒中，EC1118產(chǎn)生的大多數(shù)化合物濃度最高，但苯乙酸乙酯、葡萄螺烷、對乙烯基愈創(chuàng)木酚和1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘在自然發(fā)酵的冰酒中含量更高。SYNOS等[8]以品麗珠為原料，使用3種酵母(V1116、EC1118、VL1)進行發(fā)酵并和自然發(fā)酵進行比對，發(fā)現(xiàn)EC1118和自然發(fā)酵冰酒的香氣活性物質(zhì)含量最高，但是兩者的香氣活性物質(zhì)種類有很大差異。而在我國的冰葡萄酵母的研究中，裴廣仁等[9]選用了9種商業(yè)酵母進行冰酒發(fā)酵，從冰酒的理化指標、風(fēng)味組成和感官分析3方面綜合分析，認為WY1、WY3、WY4 具有發(fā)酵優(yōu)質(zhì)冰酒的潛力。張小倩等[10]對4種不同釀酒酵母(ST、K1、EC1118、R2)發(fā)酵的威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性化合物進行分析，結(jié)果表明，R2酵母發(fā)酵的冰葡萄酒中醇類、酯類、羰基化合物的含量具有明顯優(yōu)勢，且1-辛烯-3-醇、1-己醇、β-大馬士酮、里那醇、香葉醇、1-辛烯-3-酮等香氣化合物含量明顯高于其他酵母。上述研究可以發(fā)現(xiàn)，目前針對不同酵母對冰酒風(fēng)味影響方面已經(jīng)進行了較為詳細的研究，但是冰酒釀造過程中的香氣動態(tài)變化規(guī)律則鮮有人探究。

因此，本研究以遼寧本溪桓仁的威代爾冰葡萄為試材，采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction coupled with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrum, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)對其發(fā)酵過程中不同時期的香氣化合物進行測定分析，研究威代爾冰葡萄酒酵過程中香氣化合物的變化規(guī)律。該研究不僅能豐富冰葡萄酒風(fēng)味化學(xué)研究的理論基礎(chǔ)，同時也為進一步調(diào)控冰葡萄酒風(fēng)味質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：2018年威代爾冰葡萄，遼寧本溪桓仁。

酵母：R2酵母，法國Lallemand公司。

試劑：2-辛醇、甲醇、二氯甲烷(色譜純)，美國 Sigma-Aldrich 公司；NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、偏重硫酸鉀(分析純)，上海國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國 Millipore公司；固相萃取裝置，美國 Supelco 公司；Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，LECO Corp., St. Joseph, MI, USA；Agilent DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)， Palo Alto, CA, USA; Restek Rxi-17Sil MS二維色譜柱(1.5 m×0.25 mm，0.25 μm), Bellefonte, PA, USA。

1.3 實驗方法

1.3.1 冰葡萄酒發(fā)酵及取樣

發(fā)酵溫度(12±1)℃，從發(fā)酵第0 天開始，每隔7 d取樣1次，直到發(fā)酵結(jié)束的第42天停止，共7個取樣點。

1.3.2 理化指標的測定

冰葡萄酒中總糖、總酸、pH、乙醇體積分數(shù)的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行[11]。

1.3.3 HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性分析

1.3.3.1 HS-SPME步驟

在20 mL頂空瓶中加入5 mL冰葡萄酒樣品及1.5 g NaCl，并添加10 μL 2-甲氧基苯酚-D3(內(nèi)標物終質(zhì)量濃度為609.76 μg/L)，具體程序：樣品萃取溫度為50 ℃，平衡時間為5 min，萃取時間為45 min，萃取時轉(zhuǎn)速為250 r/min。萃取頭于250 ℃下解吸附5 min，不分流。

1.3.3.2 GC×GC-TOFMS分析

GC×GC-TOFMS分析及質(zhì)譜條件參照本課題組前期優(yōu)化建立的方法[12]。

定性分析：對由Pegasus 4D工作站采集的數(shù)據(jù)，使用儀器自帶ChormaTOF軟件來解析，一維色譜峰的峰寬設(shè)為24 s，二維色譜峰寬設(shè)為0.2 s，自動識別大于200信噪比的色譜峰，然后進行自動積分解卷積和質(zhì)譜庫(NIST14，Wiley 9)比對。相似度大于700作為篩選化合物的標準，去除色譜柱流出物含硅化合物與沒有風(fēng)味貢獻的化合物，作為初步鑒定結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，相同條件下分析一系列正構(gòu)烷烴(C5～C30)的保留時間來確定每個化合物的色譜柱保留指數(shù)，并與文獻報道的保留指數(shù)比對確認，偏差在30以內(nèi)的化合物作為最終定性的結(jié)果。

半定量分析：根據(jù)內(nèi)標物的含量計算定性得到的化合物的相對含量，并進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019對威代爾冰葡萄酒中揮發(fā)性化合物定量數(shù)據(jù)進行計算；使用SPSS 22進行單因素方差分析(ANOVA)；使用SIMCA 13.0進行偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化指標的測定

針對發(fā)酵初始第0天的冰葡萄汁和發(fā)酵結(jié)束第42天的冰葡萄酒的基本理化指標進行了測定，通常發(fā)酵冰酒的葡萄汁含糖量介于300～400 g/L，總酸在8～12 g/L。而國標中規(guī)定冰葡萄酒的殘?zhí)遣坏玫陀?25 g/L，乙醇體積分數(shù)為9%～14%。根據(jù)理化指標的檢測數(shù)據(jù)可以看出，采用R2酵母釀造的冰葡萄酒總糖為141.5 g/L，乙醇體積分數(shù)為10.2%，均符合冰葡萄酒國家標準和工藝要求[13]。

表1 冰葡萄汁及冰葡萄酒的基本理化指標Table 1 Chemical composition of the Vidal ice wine juice and Vidal ice wine

2.2 發(fā)酵過程中冰葡萄酒游離態(tài)香氣化合物組分分析

2.2.1 冰葡萄酒游離態(tài)香氣化合物的定性分析

在所有發(fā)酵過程中的冰葡萄酒樣中共定性出507種揮發(fā)性香氣化合物，其中酯類131種、萜烯類45種、醇類97種、酸類25種、含氮化合物10種、揮發(fā)酚類20種、含硫化合物5種、芳香族化合物68種、內(nèi)酯類19種、醛類22種、酮類50種、呋喃類15種。各類化合物所占比例如圖1所示，其中酯類化合物種類所占的比例最多，占總量的25.84%，其次是醇類、芳香族及萜烯類化合物。

圖1 發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣化合物種類匯總Fig.1 Summary of volatile aroma compounds during fermentation

2.2.2 冰葡萄酒游離態(tài)香氣化合物的定量分析

通過對發(fā)酵過程中酒樣的各類別化合物的含量分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，醇類、芳香族類、酯類、酸類、萜烯類、酚類、含氮類、呋喃類、內(nèi)酯類、醛類化合物的總含量初期都是隨著發(fā)酵的進行逐漸增加，并在發(fā)酵第14天時達到最高，隨后含量降低并趨于穩(wěn)定；而酮類化合物總含量隨著發(fā)酵的進行一直降低，在發(fā)酵第14天時含量達到最低后趨于穩(wěn)定；含硫類化合物則是隨著發(fā)酵的進行含量逐漸升高，并在發(fā)酵第28天達到最高，隨后又逐漸降低。

圖2 發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣化合物含量變化Fig.2 Change of volatile aroma compounds in fermentation process 注:黑色圖例化合物含量對應(yīng)左邊縱坐標； 白色圖例化合物含量對應(yīng)右邊縱坐標

通過比較發(fā)酵初始與發(fā)酵結(jié)束2個時間點(發(fā)酵第0天與發(fā)酵第42天)的各類化合物含量發(fā)現(xiàn)，除酮類化合物含量減少，酯類、醇類、酸類、萜烯類、內(nèi)酯類、芳香族類、酚類、醛類、醚類、含氮化合物類、含硫類化合物含量均增加。根據(jù)以上的結(jié)果，主要針對發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物中既具有香氣特征(與香氣物質(zhì)數(shù)據(jù)庫Flavornet Home進行比對[14])同時具有顯著性差異的香氣化合物進行匯總分析，結(jié)果見表2。

酯類：在發(fā)酵過程中酯類化合物的含量有顯著性差異的共有22種，其中乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、十一酸乙酯、戊酸乙酯等的相對含量較高。這些呈果香味的酯類的含量較發(fā)酵前都有所增加，乙酸異戊酯(香蕉香)的含量經(jīng)過發(fā)酵后增加了35%，乙酸異丁酯(水果香)、乙酸丁酯(梨香)、丁二酸二乙酯(水果香氣)、丁酸乙酯(蘋果香氣)、十一酸乙酯(椰子香)、戊酸乙酯(水果香)的含量在經(jīng)過發(fā)酵后分別增加了2～3倍。經(jīng)過發(fā)酵后的提供果香的中長鏈脂肪酸酯的含量增加，會明顯的改善冰酒的感官品質(zhì)[15]，并且這種變化也與以往威代爾冰葡萄酒發(fā)酵過程中酯類的變化規(guī)律相似[16]。

醇類：發(fā)酵階段揮有顯著性變化的醇類共有22種。在發(fā)酵結(jié)束的酒中，1-己醇、2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、1-丙醇、3-辛醇的含量較高。經(jīng)過發(fā)酵后，具有花香、甜香、青草味的1-己醇增加了11%，呈水果香氣的2,3-丁二醇比發(fā)酵前的冰葡萄汁含量增加了2倍，黃瓜香氣的2-壬醇增加了3倍。

酸類：在整個發(fā)酵過程中，6種酸的含量有顯著性差異，其中己酸、丁酸、癸酸、十二酸、戊酸等中長鏈脂肪酸的含量都增加，這也與葡萄酒發(fā)酵發(fā)酵過程中羧酸類化合物的變化趨勢一致[17]，較高的酸類物質(zhì)會給葡萄酒風(fēng)味帶來負面影響，但是也有研究顯示較低含量的酸可以通過增加香氣的復(fù)雜性來提高葡萄酒的品質(zhì)[18]。而乙酸作為高糖脅迫下酵母產(chǎn)生的主要揮發(fā)酸，其含量會影響冰到葡萄酒的質(zhì)量[19]。發(fā)酵結(jié)束時乙酸的含量比發(fā)酵前增加了2倍，并且在發(fā)酵結(jié)束后乙酸酯的含量增加也可能與乙酸的含量增加相關(guān)。

醛、酮類：在GC-MS分離過程中，羰基化合物和酯類的分離比較困難，往往檢出率較低[17]，但是在GC×GC-TOFMS的分離下，有較多的羰基化合物檢出。醛酮類化合物的總含量隨著發(fā)酵的進行而降低，在5種具有顯著性的醛類中呈柑橘香氣的壬醛相對含量最高，其次是呈杏桃香氣的桃醛，且這5種醛在發(fā)酵結(jié)束后含量都降低。酮類中的呈奶油香氣閾值的2,3-丁二酮含量較發(fā)酵前明顯降低，但呈熱牛奶香氣的2-壬酮的含量卻從6.97 g/L增加到了43.60 g/L。

萜烯類：萜烯類化合物雖然在葡萄酒中含量較低，但因其較低的閾值，而對葡萄酒的香氣有較大的貢獻。經(jīng)過發(fā)酵，具有顯著性差異的萜烯化合物共有24種，其中冰葡萄酒中比較重要的物質(zhì)，如呈現(xiàn)花香的橙花醚、玫瑰醚和蜂蜜香氣的β-大馬酮、花香和木香的芳樟醇、檸檬香氣的松油烯[20]的含量都比較高。萜烯含量的增加，一方面可能在冰酒較長的發(fā)酵時間中通過酸解對糖苷結(jié)合態(tài)的萜烯類化合物進行較好的釋放，另一方面也有可能R2酵母具有β-葡萄糖苷酶的活性，通過酶解對結(jié)合態(tài)香氣進行釋放，其具體釋放原因還有待進一步研究。

芳香族類：苯甲醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯的含量都比較高，且這些物質(zhì)都主要呈現(xiàn)花果香和甜香，尤其是呈現(xiàn)玫瑰香氣的乙酸苯乙酯的含量最高，其次是苯乙醇含量在發(fā)酵結(jié)束時有明顯增加，其不僅可在發(fā)酵過程中形成，也可由結(jié)合態(tài)香氣前體釋放[21]，這種增加也在之前的研究中有相關(guān)報道[18]。其他幾種芳香族化合物也有不同程度的增加，但是沒有苯乙醇的含量增加顯著。

2.2.3 PLS-DA分析

將具有顯著性差異的揮發(fā)性化合物進行PLS-DA分析，最終，有36個化合物的變量投影重要性值大于1.0。根據(jù)這36個差異化合物作圖(圖3)，7個取樣點的樣品聚集在不同的分區(qū)，其中發(fā)酵前期3個取樣點的差異明顯，也就說明在發(fā)酵初始階段，葡萄汁中的揮發(fā)性香氣化合物的種類與含量會隨著發(fā)酵的進行產(chǎn)生很大的變化，發(fā)酵第0天與己酸己酯、2,3-戊二酮、2,3-丁二酮、香草酸乙酯相關(guān)性較高，發(fā)酵第7天則與香葉醇相關(guān)，發(fā)酵第14天與壬醛、1-辛烯-3-酮、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、2,3-丁二醇、丁酸甲酯、苯酚相關(guān)。在發(fā)酵的后期冰葡萄酒中的揮發(fā)性成分已經(jīng)趨于一個較穩(wěn)定的狀態(tài)，到發(fā)酵中后期的樣本則比較聚集，主要與香茅醇、芳樟醇、3-辛酮相關(guān)；發(fā)酵結(jié)束的第42天則與水芹烯、1-丁醇、松油烯、γ-萜品烯、DL-檸檬烯、1,4-桉葉素、芳樟醇氧化物等化合物相關(guān)。最終經(jīng)過酵母發(fā)酵，冰葡萄汁和冰葡萄酒的揮發(fā)性組分已經(jīng)有了明顯區(qū)別。果酒經(jīng)過酵母發(fā)酵后，無論是香氣物質(zhì)的種類和含量都會發(fā)生一定變化，與孫佳勰等[22]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初始與發(fā)酵結(jié)束后香氣物質(zhì)產(chǎn)生顯著差別，而發(fā)酵后期香氣變化相對較小，樣本則更為集中的結(jié)果相一致。

圖3 發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣化合物PLS-DA圖Fig.3 Volatile aroma compounds analysis with PLS-DA

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析了R2酵母發(fā)酵威代爾冰葡萄酒在發(fā)酵過程中香氣化合物的變化規(guī)律，結(jié)果表明，R2酵母發(fā)酵后冰葡萄酒的揮發(fā)性組分較初始發(fā)生了明顯變化，醇類、芳香族類、酯類、酸類、萜烯類、酚類、含氮類、呋喃類、內(nèi)酯類、醛類化合物的總含量都是隨著發(fā)酵的進行逐漸增加，并在發(fā)酵第14天時達到最高，隨后含量降低并趨于穩(wěn)定。而酮類化合物總含量隨著發(fā)酵的進行一直降低，在發(fā)酵第14天時含量最低后趨于穩(wěn)定；含硫類化合物則是隨著發(fā)酵的進行含量逐漸升高，隨后又逐漸降低。此外，通過對比發(fā)酵前后結(jié)合態(tài)化合物含量變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束時，除酮類化合物含量減少，其他類化合物含量均增加。PLS-DA分析結(jié)果表明發(fā)酵前期(0、7、14 d)揮發(fā)性化合物變化較為顯著，到發(fā)酵中后期的樣本則相對變化較小，揮發(fā)性化合物趨于一個較穩(wěn)定的狀態(tài)。