李曉虹，湯惠茹，李雨珊，曾玉翠，魏蔚霞，黃斌，杜輝，吳瑞芳，2*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳 518036；2.深圳市女性重大疾病早期診斷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518036)

世界衛(wèi)生組織公布的《世界癌癥報(bào)告》顯示2018年全球新增860萬例女性癌癥患者，其中乳腺癌是最常見的癌癥類型，占女性癌癥病例的近1/4[1]。而約70%的育齡期女性在診斷為乳腺癌時(shí)仍有生育意愿[2]。眾所周知，大多數(shù)癌癥治療，如化療、放療或兩者的結(jié)合都是對(duì)性腺有生殖毒性的，導(dǎo)致患者在治療結(jié)束后出現(xiàn)卵巢早衰和不孕。因此卵巢組織凍存和移植具有廣闊的應(yīng)用前景。玻璃化冷凍是一種快速的冷凍方法，它通過使細(xì)胞內(nèi)外液態(tài)直接轉(zhuǎn)化為非晶體的玻璃化態(tài)，以減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成。玻璃化冷凍不需要特殊的設(shè)備，節(jié)省了時(shí)間和成本，多年來該技術(shù)在卵巢組織冷凍的應(yīng)用中取得了重大進(jìn)展，目前已報(bào)道有通過卵巢組織玻璃化冷凍后自體移植妊娠的病例，其中已出生3例活產(chǎn)嬰兒，但卵巢組織玻璃化冷凍還缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方案，玻璃化冷凍保護(hù)液的配比和濃度需要優(yōu)化[3-5]。

本研究選擇4種公認(rèn)適用于卵巢玻璃化冷凍保存液，建立液滴法直接觀察玻璃化凍存液在液氮中快速降溫和復(fù)融時(shí)的玻璃化程度，比較此4種凍存液保存凍融后的人卵巢組織的凋亡標(biāo)志物細(xì)胞色素C(Cytochome C)與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)情況，以篩選優(yōu)化的人卵巢組織玻璃化凍存液配方，為人卵巢組織冷凍技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.研究對(duì)象：選取2018年3月至2019年12月期間在北京大學(xué)深圳醫(yī)院因婦科疾病手術(shù)治療的患者卵巢組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～40歲之間，月經(jīng)規(guī)律，因疾病需要行腹腔鏡或開腹卵巢囊腫剝除術(shù)或卵巢切除術(shù)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前3個(gè)月曾口服激素類藥物、有放化療病史及卵巢早衰。

共收集到納入符合標(biāo)準(zhǔn)的4例患者卵巢組織?；颊吣挲g為(32.8±4.2)歲，其中因乳腺癌行預(yù)防性雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)1例，卵巢顆粒細(xì)胞瘤行卵巢切除術(shù)1例，因卵巢畸胎瘤/卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫行卵巢囊腫剝除術(shù)各1例。

2.主要試劑及儀器：乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖、海藻糖(Sigma，美國(guó))；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖的M199培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；人工合成血清替代品(SSS)(Irvine Scientific，美國(guó))；4%多聚甲醛(北京索萊寶)；Cytochome C兔多克隆抗體(BA0781)、Caspase-3兔多克隆抗體(BM3957)(武漢博士德生物)；即用型免疫組化Elivision TM super試劑盒(兔/鼠)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物)；玻璃化卵巢組織凍存液(Cryotissue Kit VT301/VT302，Kitazato，日本)、冷凍管(Corning，美國(guó))、光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)、體式顯微鏡(Olympus，日本)、液氮儲(chǔ)存罐(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.卵巢組織的獲取、處理與分組：卵巢切除術(shù)者標(biāo)本離體后立即剪下卵巢皮質(zhì)，囊腫剝除術(shù)者剪下附于手術(shù)剝除的卵巢囊腫邊緣的正常卵巢皮質(zhì)，置于盛有6 ml經(jīng)HEPES緩沖的M199培養(yǎng)液(含20% SSS和100 μg/ml青/鏈霉素)的離心管中，15 min內(nèi)去除卵巢組織血跡和髓質(zhì)及肉眼可見的卵泡與黃體等周期性結(jié)構(gòu)后，分割成(5～10)mm×10 mm×1 mm大小的組織塊，隨機(jī)分成5組，分別納入凍存組和對(duì)照組。參閱有關(guān)人卵巢組織玻璃化冷凍保存的文獻(xiàn)資料[6-8]，設(shè)計(jì)4組凍存組和1個(gè)對(duì)照組。以未經(jīng)凍融處理的新鮮卵巢組織為對(duì)照組，不作凍存處理，直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。4種不同玻璃化凍存液成分如下：A凍存液(A組)為含20% EG+20% DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20% SSS+M199培養(yǎng)基[6]；B凍存液(B組)為含38%EG+0.5 mol/L海藻糖+6%SSS+M199培養(yǎng)基[7]；C凍存液(C組)為含15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20% SSS+M199培養(yǎng)基[8]；D凍存液(D組)為Cryotissue Kit VT301/VT302 商品成品，成分未知。

人卵巢組織凍存4周后，取出金屬網(wǎng)格載體，按蔗糖/海藻糖梯度解凍法復(fù)蘇人卵巢組織[3-5]，以4%多聚甲醛固定24 h后用于HE染色和免疫組化檢測(cè)。

2.液滴法觀察玻璃化凍存液狀態(tài)：將潔凈的液氮注入耐低溫的玻璃皿中，將金屬網(wǎng)格載體置于液氮中，用移液槍吸取500 μl凍存液，垂直滴在位于液氮中的網(wǎng)格載體上，將玻璃皿置于體式顯微鏡下，直接觀察凍存液在快速降溫過程中的玻璃化狀態(tài)；再將37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)注入玻璃皿2中，將玻璃皿2置于體式顯微鏡下，用鑷子夾持金屬網(wǎng)格載體，將凍存液的液滴迅速移入玻璃皿2中，直接觀察各組凍存液在37℃復(fù)融時(shí)的玻璃化狀態(tài)并拍攝記錄。凍存液在液氮低溫和復(fù)融過程中肉眼和顯微鏡下凍存液均保持透明狀為玻璃化狀態(tài)；凍存液在液氮低溫和復(fù)融過程中完全形成冰晶體，肉眼呈不透明白色，顯微鏡下呈現(xiàn)黑色鏡像為完全結(jié)晶；凍存液在液氮低溫和復(fù)融時(shí)部分形成冰晶體，肉眼呈半透明白色，顯微鏡下呈現(xiàn)部分黑色鏡像，部分仍然保持透明狀為部分結(jié)晶。

3.人卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察：取卵巢組織固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，制作厚度3 μm連續(xù)切片，每隔5張取一張進(jìn)行HE染色，鏡下觀察。每次實(shí)驗(yàn)任意選取3張切片，共進(jìn)行4次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在400倍顯微鏡下，每張切片任選5個(gè)視野根據(jù)卵泡形態(tài)的正常與否進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)。正常的卵泡為包含一個(gè)完整的卵母細(xì)胞和排列整齊的顆粒細(xì)胞層，卵母細(xì)胞或顆粒細(xì)胞未見濃縮核；出現(xiàn)卵母細(xì)胞皺縮或核固縮、顆粒細(xì)胞排列紊亂、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離或與卵泡周圍的基膜分離及基底膜不完整中任一項(xiàng)，就表明卵泡退化，視為形態(tài)結(jié)構(gòu)異常卵泡。正常卵泡率=正常卵泡數(shù)/卵泡總數(shù)×100%。

4.免疫組化染色：選擇相應(yīng)抗體對(duì)作為細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的Cytochome C和Caspase-3進(jìn)行免疫組化染色。將組織凍融后及對(duì)照組卵巢組織切片分別以1∶200稀釋的兔抗人Cytochome C抗體和Caspase-3抗體4℃孵育過夜，復(fù)溫后PBS洗3次，每次3 min，二抗選自即用型免疫組化ElivisionTM Super試劑盒，操作步驟如說明書。DAB顯色后用蘇木素進(jìn)行核復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察拍照。每次實(shí)驗(yàn)中各組對(duì)每個(gè)指標(biāo)分析3張切片，每張切片在隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)所有陽性細(xì)胞的數(shù)目。Cytochome C陽性結(jié)果為細(xì)胞漿或者細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用Image Proplus軟件根據(jù)染色部位著色深淺分析Cytochome C陽性表達(dá)并計(jì)算平均累積光密度，平均累積光密度=IOD(SUM)/Area(SUM)。Caspase-3陽性結(jié)果為細(xì)胞核染成棕黃色，陽性率=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位間距)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)Kruskal-Wallis法；計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示，組間分析比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組凍存液在快速降溫和復(fù)融時(shí)的玻璃化比較

在液氮中快速降溫時(shí)A、B和D組凍存液均保持完全的玻璃化狀態(tài)，玻璃液C凍存液大部分為玻璃化狀態(tài)，僅周邊見少許黑色的結(jié)晶形成(圖1)。在復(fù)融過程中，A、B和C組凍存液出現(xiàn)大塊黑色的結(jié)晶，隨著溫度上升，黑色結(jié)晶逐漸消失；D組凍存液則在整個(gè)復(fù)融過程中絕大部分保持透明的玻璃化狀態(tài)，只有少量黑色結(jié)晶(圖2)。

二、各組凍融后人卵巢組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

HE染色顯示，各組卵巢組織均可見正常形態(tài)的卵泡和閉鎖卵泡，絕大部分卵泡在凍融后可以維持正常的形態(tài)。凍存組的異常卵泡表現(xiàn)為卵泡形態(tài)不規(guī)則，顆粒細(xì)胞分散、不連續(xù)，核固縮，基底膜斷裂等(圖3)。由于凍存卵巢組織中初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡較少，僅統(tǒng)計(jì)原始卵泡的正常率，各組卵巢組織的原始卵泡正常率與對(duì)照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

A～D示凍存液A～D組；箭頭示結(jié)晶圖1 各組凍存液在液氮快速降溫時(shí)的玻璃化比較(×10)

A～D示凍存液A～D組；箭頭示結(jié)晶圖2 各組凍存液在復(fù)融后的玻璃化比較(×10)

Ctrl：對(duì)照組；A～D示凍存液A～D組；箭頭示異常卵泡；scale bar=50 μm圖3 各組玻璃化凍存后人卵巢組織的形態(tài)學(xué)比較(HE染色)

表1 各組患者卵巢組織凍融后原始卵泡正常率(%)

三、各組人卵巢組織中凋亡特異性標(biāo)志物的表達(dá)情況

1.各組人卵巢組織中Cytochome C的表達(dá)結(jié)果比較：各組人卵巢組織凍融后的卵泡中均可見Cytochome C的表達(dá)(圖4)。對(duì)照組、A、B、C和D組的平均累積光密度中位數(shù)分別為0.01、0.03、0.03、0.10和0.02；C組Cytochome C的表達(dá)顯著高于對(duì)照組和D組(P<0.05)，其余各組比較均無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

Ctrl:對(duì)照組；A～D示凍存液A～D組；箭頭示陽性染色；scale bar=50 μm圖4 各組患者卵巢組織中Cytochome C的表達(dá)(免疫酶標(biāo)法)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05圖5 各組患者卵巢組織中Cytochome C顯色統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.各組人卵巢組織中Caspase-3的表達(dá)結(jié)果：Caspase-3在對(duì)照組的卵巢間質(zhì)細(xì)胞中基本不表達(dá)，卵泡可見弱陽性表達(dá)，在各凍存組間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中可見點(diǎn)狀表達(dá)，卵泡可見陽性表達(dá)(圖6)。C組Caspase-3陽性率顯著高于A、B、D和對(duì)照組(P<0.05)，其余各組間Caspase-3陽性率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

Ctrl：對(duì)照組；A～D示凍存液A～D組；箭頭示陽性染色；scale bar=50 μm圖6 各組患者卵泡中Caspase-3的表達(dá)(免疫酶標(biāo)法)

表2 各組患者卵巢組織中Caspase-3陽性率(%)

討 論

玻璃化冷凍用高濃度的冷凍保護(hù)劑置換細(xì)胞中的水，通過快速降溫方式，使細(xì)胞內(nèi)外的液態(tài)直接轉(zhuǎn)化為粘稠的非晶體玻璃化態(tài)，從而最大限度地降低了細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成。目前玻璃化冷凍在卵母細(xì)胞、胚胎和精子的凍存中取得了很好的效果[9-11]，但卵巢組織的成分復(fù)雜，組織塊的體積也較大，適合于細(xì)胞的玻璃化冷凍方案可能并不完全適合用于卵巢組織的冷凍。以往大部分學(xué)者較多地從卵巢組織凍融后或移植后卵泡的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)等方面間接地優(yōu)化玻璃液，操作過程繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力[12]。

本研究通過液滴法，可以方便快速地觀察凍存液在快速降溫和復(fù)融時(shí)的玻璃化程度。肉眼觀察到玻璃化的溶液保持透明，而結(jié)晶溶液則是高度不透明的白色。顯微鏡下觀察，玻璃化的溶液呈透明狀，而結(jié)晶的溶液呈黑色。雖然我們可以通過液滴法方便直接地觀察不同凍存液在液氮快速降溫和復(fù)融時(shí)的玻璃化程度，但凍存液在組織中的玻璃化卻很難觀察到的。Paredes等[13]發(fā)現(xiàn)雖然外部培養(yǎng)基發(fā)生了結(jié)晶，但小鼠卵母細(xì)胞卻仍有很高的存活率，提出細(xì)胞的存活與外部培養(yǎng)基的玻璃化或結(jié)晶關(guān)系很小或沒有關(guān)系。這可能是因?yàn)槁涯讣?xì)胞或胚胎細(xì)胞質(zhì)中含有大量的大分子(蛋白和核酸)，這將增強(qiáng)凍存液中滲透溶質(zhì)的玻璃化能力。但卵巢組織塊不同于細(xì)胞或胚胎，組織塊的體積較大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)也更為復(fù)雜，關(guān)于凍存液的玻璃化程度與其對(duì)卵巢組織的冷凍保存效果關(guān)系的研究目前尚未見報(bào)道。

本研究選擇的4種凍存液在相同的條件下，A、B和D組凍存液在液氮中可以保持完全玻璃化狀態(tài)，而C凍存液在液氮中不能保持完全的玻璃化狀態(tài)，出現(xiàn)部分結(jié)晶。其中A、B和C組凍存液的滲透性冷凍保護(hù)劑的總濃度不同，C組凍存液的總濃度為40%(20% EG和20% DMSO)，B組凍存液的總濃度為38%(38% EG)，C組凍存液的總濃度為30%(15% EG和15% DMSO)。通常認(rèn)為玻璃化需要較高的冷卻速率或較高濃度的冷凍保護(hù)劑。在相同的條件下，凍存液的濃度越高，越容易形成玻璃化狀態(tài)，但高濃度的冷凍保護(hù)劑在置換細(xì)胞內(nèi)的水的過程中，如果超過細(xì)胞的滲透耐受極限，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的泄漏和不可逆的損傷[14]。因而在優(yōu)化凍存液時(shí)，尋找合適的冷凍保護(hù)劑濃度非常重要。本研究中C組凍存液的滲透性冷凍保護(hù)劑的總濃度最低，C組人卵巢組織中的晚期凋亡指標(biāo)Caspase-3的表達(dá)顯著高于A和B組，可能是由于C組凍存液在快速降溫時(shí)出現(xiàn)部分結(jié)晶，而這些冰晶會(huì)對(duì)組織細(xì)胞造成破壞，從而影響了冷凍保存效果。

在各組凍存液升溫復(fù)融過程中，我們觀察到升溫的最初幾秒鐘，A、B和C組凍存液均出現(xiàn)結(jié)晶，隨著溫度進(jìn)一步上升后，冰晶才再次融解，而D組凍存液在整個(gè)復(fù)融過程中絕大部分能保持透明的玻璃態(tài)。Yavin等[15]研究發(fā)現(xiàn)凍存液的復(fù)融的過程其實(shí)比冷凍過程更為重要。在升溫復(fù)融的過程中，細(xì)胞內(nèi)的小冰晶由于表面自由能的差異可以轉(zhuǎn)化為大冰晶即再結(jié)晶。Mazur等[16]在小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后復(fù)融過程中，通過顯微鏡觀察到卵母細(xì)胞因細(xì)胞內(nèi)的再結(jié)晶而呈現(xiàn)黑色，認(rèn)為能否防止細(xì)胞內(nèi)玻璃化的再結(jié)晶是卵母細(xì)胞能否存活的更關(guān)鍵因素。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然A、B和D組凍存液均能在液氮中保持玻璃化狀態(tài)，但只有D組凍存液在復(fù)融過程中可以絕大部分保持玻璃化狀態(tài)。雖然經(jīng)過4組凍存液處理凍融后的卵巢組織的卵泡正常率與對(duì)照組比無顯著差異(P>0.05)，但D組人卵巢組織的卵泡早期凋亡指標(biāo)Cytochome C和晚期凋亡的指標(biāo)Caspase-3的表達(dá)均顯著低于C組(P<0.05)。正常情況下Cytochome C存在于線粒體內(nèi)，參與線粒體呼吸鏈電子傳遞和細(xì)胞凋亡過程，但Cytochome C在細(xì)胞凋亡因素刺激下由線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Cytochome C可以激活Caspase-3，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡階段。我們的研究結(jié)果提示在快速降溫和復(fù)融中能夠保持良好玻璃化狀態(tài)的冷凍保護(hù)液比在快速降溫和復(fù)融時(shí)均不能保持完全玻璃化玻璃液的冷凍效果更好，組織凋亡更少，但體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還需要通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究通過液氮液滴法可方便直觀地觀察凍存液在快速降溫和復(fù)融時(shí)的玻璃化狀態(tài)，并可將其用于人卵巢組織玻璃化凍存液的初篩。在快速降溫和復(fù)融時(shí)均能保持較好玻璃化狀態(tài)的D組(商品化成品)凍存液保護(hù)人卵巢組織細(xì)胞凋亡較少，效果優(yōu)于C組凍存液。