李瑞嬌，張汝月，郭興萍，張引紅，李紅霞

(山西省生殖科學(xué)研究所，出生缺陷與細(xì)胞再生山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006)

近年來(lái)，隨著不孕癥發(fā)生率的逐年上升[1]，輔助生殖技術(shù)廣受關(guān)注。子宮內(nèi)膜作為胚胎著床的重要場(chǎng)所，狀態(tài)好壞直接影響著手術(shù)的成敗。數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm是胚胎成功著床的關(guān)鍵指標(biāo)，小于6 mm時(shí)著床成功率則會(huì)發(fā)生明顯下降[2]。對(duì)于成功妊娠的最低子宮內(nèi)膜厚度下限，目前尚無(wú)統(tǒng)一說(shuō)法，但通常將低于7 mm的子宮內(nèi)膜稱為薄型子宮內(nèi)膜[3]。薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)生大多表現(xiàn)為藥物流產(chǎn)、刮宮等宮腔操作手術(shù)的后續(xù)反應(yīng)，此外部分患者會(huì)出現(xiàn)伴隨著年齡增加而子宮內(nèi)膜變薄的情況[4]。研究發(fā)現(xiàn)，薄型子宮內(nèi)膜通常伴隨著動(dòng)脈血流壓力增大，血供不足，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)下調(diào)，腺上皮細(xì)胞增殖受限等[5]。針對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的臨床治療方法較多，例如內(nèi)膜局部搔刮、激素補(bǔ)充、藥物刺激、電刺激等，但都效果有限，且個(gè)體差異較為明顯[6]。

干細(xì)胞是一種具有強(qiáng)大自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞[7]。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞作為基于子宮內(nèi)膜本身的自體干細(xì)胞，有著易于定向分化和低免疫原性的優(yōu)勢(shì)[8]。本實(shí)驗(yàn)將小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植至制作好的薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型中，獲得了明顯的修復(fù)效果，為臨床薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù)提供思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6J小鼠288只，SPF級(jí)，8周齡(性成熟且未交配)，體重19～22 g；雄性C57BL/6J小鼠36只，SPF級(jí)，10周齡(預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定有生育能力)，體重22～25 g。均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)條件：山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境，每5只一籠，溫度(25±2)℃，濕度(55±2)%，光照明暗時(shí)間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。本實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)液MesenCultTMExpansion Kit(Mouse)、L-Glutamine(STEMCELL，加拿大)；戊巴比妥鈉(Ceres Chemical，美國(guó))；無(wú)水乙醇、甲醛、二甲苯(上海國(guó)藥試劑)；生理鹽水(山東華魯制藥)；伊紅、蘇木素、中性樹(shù)脂(武漢Bioswamp)；SP Rabbit & Mouse HRP Kit(DAB)(北京康為世紀(jì))；pan-cytpkeratin(H-240)：sc-15367(Santa cruz，美國(guó))、ERα(hc-20)：sc-543(Santa cruz，美國(guó))、monoclonalanti-vimentin：V-6630(Sigma，美國(guó))、VEGF antibody(VG-1)：ab1316(Abcam，英國(guó))。

研究級(jí)正置顯微鏡(Olympus IX51，日本)；組織脫水機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械)；石蠟包埋機(jī)(湖北泰維科技)；石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))；攤片烤片機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國(guó))；倒置顯微鏡(Leica，德國(guó))。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)：基于間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似特性，采用加拿大STEMCELL公司特配的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞富集培養(yǎng)液以貼壁培養(yǎng)的方法對(duì)C57BL/6J小鼠子宮細(xì)胞進(jìn)行富集培養(yǎng)；并利用流式細(xì)胞儀對(duì)所獲干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記鑒定，包括CD29/CD45/CD73/CD90/CD105。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P5細(xì)胞從培養(yǎng)瓶消化下來(lái)，消化方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。將消化所得酶液和細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的15 ml離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，收集沉淀。加入PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，終濃度為5×105/ml，備用。具體操作參見(jiàn)本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[9]。

2.薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型的建立：采用宮腔注射95%乙醇的方法，并通過(guò)形態(tài)觀察、子宮內(nèi)膜厚度測(cè)定、HE染色、免疫組化、生育力評(píng)估對(duì)模型進(jìn)行鑒定。具體操作參見(jiàn)本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[10-11]。

3.分組處理：288只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、干細(xì)胞移植組，每組96只?？瞻讓?duì)照組不做任何處理；模型對(duì)照組宮腔注射95%乙醇損傷后立即原位注射PBS 0.1 ml，3 d后尾靜脈注射PBS 1 ml；干細(xì)胞移植組宮腔注射95%乙醇損傷后立即原位注射子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞0.1 ml，3 d后尾靜脈注射子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞1 ml。此時(shí)記為第0天，分別于第3、7、14、30天取樣及合籠。

每組根據(jù)取樣時(shí)間(3 d、7 d、14 d、30 d)不同分為4小組。取樣當(dāng)日，半數(shù)小鼠麻醉后獲取子宮組織后立即放入4%多聚甲醛中固定；半數(shù)小鼠通過(guò)合籠懷孕情況，進(jìn)行生育力評(píng)估。

4.子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)：取出固定好的子宮，脫水透明后用石蠟豎直包埋，包埋好后可見(jiàn)圓形宮腔，切片，厚度為5 μm。HE染色后顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)，并使用Leica Qwin plus圖像處理軟件對(duì)子宮內(nèi)膜厚度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量位置為子宮內(nèi)膜上皮層至肌層的垂直距離，每個(gè)樣本取3個(gè)不同位置進(jìn)行測(cè)量，求均值。

5.子宮內(nèi)膜再生評(píng)估：以免疫組化染色方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜中角蛋白(Cytokeratin，CK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、雌激素受體α(ERα)的表達(dá)，以評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的再生情況[10-11]，實(shí)驗(yàn)方法參考SP Rabbit & Mouse HRP Kit(DAB)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。其中CK一抗pan-cytpkeratin(H-240)：sc-15367稀釋倍數(shù)為1∶50，抗原修復(fù)方法為檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)10 min；Vim一抗monoclonalanti-vimentin：V-6630稀釋倍數(shù)為1∶200，抗原修復(fù)方法同樣為檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)10 min；VEGF一抗antibody(VG-1)：ab1316稀釋倍數(shù)為1∶150，抗原修復(fù)方法為EDTA緩沖液高壓修復(fù)10 min；ERα一抗(hc-20)：sc-543稀釋倍數(shù)為1∶100，抗原修復(fù)方法為檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)20 min。評(píng)價(jià)指標(biāo)采用平均光密度法，使用Imagepro-plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組免疫組化切片進(jìn)行分析，平均光密度(AOD meandensity)=IOD(integrated optical density)累積光密度/area。每張切片選擇3個(gè)高倍鏡視野，求均值。圖片放大倍數(shù)為200倍。

6.生育力評(píng)估：每天下午17：30以雌雄2∶1的比例將實(shí)驗(yàn)小鼠與確定有生殖能力的雄鼠進(jìn)行合籠交配。每天早上08：00觀察陰栓，以確定是否成功交配。

若交配成功，即將雌、雄小鼠分開(kāi)飼養(yǎng)，并進(jìn)行標(biāo)記。若交配不成功，繼續(xù)合籠，但合籠大約2周后，停止合籠。觀察到陰栓約16.5 d后，將雌性小鼠頸椎脫臼處死以確定懷孕情況。暴露子宮，觀察小鼠子宮妊娠情況，記錄并分析[11]。

四、數(shù)據(jù)分析

結(jié) 果

一、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞

圖1 第三代小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(×100)

二、子宮形態(tài)變化圖

因小鼠為雙子宮動(dòng)物，考慮單側(cè)實(shí)驗(yàn)便于與另一側(cè)作為對(duì)照，所以每次實(shí)驗(yàn)選擇單側(cè)損傷，單側(cè)修復(fù)。經(jīng)過(guò)損傷(及處理)后30 d，與空白對(duì)照組(圖2A)相比，模型對(duì)照組針孔上方有明顯結(jié)節(jié)，頂部皺縮(圖2B)，有一定程度的宮腔粘連，猜測(cè)為宮腔炎癥所導(dǎo)致。干細(xì)胞移植組形態(tài)明顯較為規(guī)則，外觀流暢，恢復(fù)較好(圖2C)。

三、子宮內(nèi)膜厚度分析

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，空白對(duì)照組子宮內(nèi)膜變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；模型對(duì)照組子宮內(nèi)膜輕微增厚，但3 d和7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，14 d和30 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)見(jiàn)部分樣本纖維化，無(wú)法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)；干細(xì)胞移植組隨著時(shí)間延長(zhǎng)，子宮內(nèi)膜逐漸增厚，各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中7～14 d增幅較大，而3～7 d、14～30 d增幅較緩(表1)。

模型對(duì)照組可測(cè)量厚度的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)膜厚度均顯著薄于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照組(P<0.05)，且顯著薄于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的干細(xì)胞移植組(P<0.05)；干細(xì)胞移植組與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較，仍有顯著差異(P<0.05)(表1)。

A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：干細(xì)胞移植組圖2 不同組別小鼠30 d亞組子宮大體形態(tài)圖

表1 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜厚度分析[μm，(-±s)]

四、子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)分析

隨著近年來(lái)的經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，基層農(nóng)村在農(nóng)業(yè)建設(shè)和農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)領(lǐng)域取得了令人矚目的成就，農(nóng)業(yè)機(jī)械化進(jìn)程也在不斷推進(jìn)。但由于各地農(nóng)業(yè)發(fā)展基礎(chǔ)不一，與全面實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)機(jī)械化和現(xiàn)代化建設(shè)還有差距，特別是當(dāng)前基層農(nóng)機(jī)的管理服務(wù)上，還無(wú)法實(shí)現(xiàn)全面保障服務(wù)，影響了部分地區(qū)的農(nóng)業(yè)效率和農(nóng)業(yè)發(fā)展步伐，面對(duì)當(dāng)前農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然要求，必須要扎實(shí)解決好基層農(nóng)機(jī)綜合管理服務(wù)問(wèn)題，確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有效進(jìn)行，發(fā)揮農(nóng)業(yè)機(jī)械化發(fā)展的現(xiàn)實(shí)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)我國(guó)從農(nóng)業(yè)大國(guó)向農(nóng)業(yè)強(qiáng)國(guó)的邁進(jìn)。

空白對(duì)照組子宮內(nèi)膜較厚，上皮層細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿，基質(zhì)層細(xì)胞均勻分布，各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)膜層、基質(zhì)層厚度均無(wú)明顯差異(圖3A1～4)。模型對(duì)照組子宮損傷明顯，上皮細(xì)胞扁平，內(nèi)膜層、基質(zhì)層均見(jiàn)明顯變薄，隨時(shí)間延長(zhǎng)自身修復(fù)不明顯；14～30 d纖維化程度逐漸嚴(yán)重，比例增多(圖3B1～4)。干細(xì)胞移植組3 d時(shí)子宮內(nèi)膜有了輕微改善，上皮面出現(xiàn)弧度；7 d時(shí)上皮層及基質(zhì)層厚度均增加，至30 d子宮內(nèi)膜逐漸增厚，內(nèi)膜層、基質(zhì)層均可見(jiàn)明顯修復(fù)，但與正常對(duì)照組相比，仍有一定差距(圖3C1～4)。

A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：干細(xì)胞移植組；1～4分別示取材時(shí)間點(diǎn)3 d、7 d、14 d、30 d圖3 不同組別小鼠子宮組織形態(tài)(HE染色 ×40)

高倍率圖片顯示各組30 d的子宮組織形態(tài)(圖4)?？汕逦吹娇瞻讓?duì)照組上皮層完整，上皮面弧度多樣，腺體豐富；而模型對(duì)照組均為實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，無(wú)明顯上皮基質(zhì)區(qū)分，腺體幾乎不可見(jiàn)；干細(xì)胞移植組細(xì)胞密度略低于空白對(duì)照組，但上皮細(xì)胞體積增大，柱狀緊密排列，腺體增加，相比模型對(duì)照組有明顯改善。

A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：干細(xì)胞移植組；箭頭示子宮內(nèi)膜上皮層，五角星示腺體增加圖4 不同組別小鼠30 d亞組子宮組織形態(tài)(HE染色 ×200)

五、免疫組化數(shù)據(jù)分析及圖片觀察

參照小鼠薄型子宮內(nèi)膜模型建立[10-11]指標(biāo)選取相關(guān)于子宮內(nèi)膜再生的分子標(biāo)記物進(jìn)行評(píng)估，包括角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、雌激素受體(ERα)。

空白對(duì)照組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CK、Vim、VEGF、ERα表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；模型對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)，CK表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而30 d時(shí)Vim、VEGF、ERα 均與3 d組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)?？梢?jiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)，子宮內(nèi)膜有一定自我修復(fù)，但對(duì)于損傷至基底層的模型而言，修復(fù)效果甚微；干細(xì)胞移植組隨時(shí)間延長(zhǎng)各組數(shù)據(jù)均在逐漸改善，3 d與7 d、7 d與14 d、14 d與30 d比較發(fā)現(xiàn)，各組表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中CK、Vim、ERα表達(dá)在7 d至14 d組差異最為明顯，VEGF表達(dá)則在14 d至30 d組達(dá)到最大差異(表2、圖5)。

組間比較發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組各檢測(cè)指標(biāo)均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，且7 d、14 d、30 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各檢測(cè)指標(biāo)均顯著低于干細(xì)胞移植組(P<0.05)；干細(xì)胞移植組各檢測(cè)指標(biāo)與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，同樣具有顯著差異(P<0.05)。由此可見(jiàn)，干細(xì)胞移植后的子宮內(nèi)膜狀態(tài)雖與空白對(duì)照組子宮的完好生理狀態(tài)有一定差距，但對(duì)子宮內(nèi)膜的損傷后修復(fù)亦有明顯作用(表2、圖5)

表2 不同組別小鼠子宮內(nèi)膜再生相關(guān)分子表達(dá)結(jié)果比較[(-±s)，n=12)

A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：干細(xì)胞移植組圖5 不同組別小鼠處理后30 d子宮內(nèi)膜組織再生相關(guān)分子的表達(dá)(免疫組化染色 ×200)

六、生育力評(píng)估

子宮內(nèi)膜的厚度是子宮形態(tài)是否正常的一個(gè)重要指標(biāo)，但只有懷孕并娩出才真正意味著生育力的修復(fù)[12]。本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組懷孕率接近為0，僅30 d組懷孕一例；干細(xì)胞移植組隨時(shí)間延長(zhǎng)，懷孕率逐漸增加，30 d后最終懷孕率達(dá)50%，與空白對(duì)照組的66.7%雖還有一定差距，但也明顯高于模型對(duì)照組，足以證明干細(xì)胞對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù)具有一定效果(表3)。

表3 各組小鼠妊娠情況[n(%)]

討 論

近年來(lái)，隨著干細(xì)胞技術(shù)的大力發(fā)展及再生醫(yī)學(xué)的興起，干細(xì)胞對(duì)各種疾病的治療研究也越來(lái)越多，幾乎遍布全身各大組織系統(tǒng)[13]。例如慢性腎臟病[14]、變應(yīng)性鼻炎[15]、糖尿病輔助治療[16]、支氣管胸膜瘺[17]、骨關(guān)節(jié)炎[18]等，都取得了不同程度的進(jìn)展。在子宮損傷修復(fù)領(lǐng)域，干細(xì)胞的探索也獲得了眾多成果[19]。研究顯示，對(duì)薄型子宮內(nèi)膜進(jìn)行不同來(lái)源的干細(xì)胞移植，出現(xiàn)不同程度的子宮內(nèi)膜增厚、腺體增加、血管再生，懷孕率上升等[20]。目前針對(duì)干細(xì)胞對(duì)薄型子宮可能的的修復(fù)機(jī)制尚不明確，主要包括細(xì)胞遷移、再生、分化、免疫調(diào)節(jié)、旁分泌作用等多種認(rèn)知。傳統(tǒng)的研究認(rèn)為，干細(xì)胞有著相當(dāng)高的增殖能力及多方向分化潛能，因此對(duì)子宮內(nèi)膜的再生主要體現(xiàn)在干細(xì)胞移植后的增殖和分化。研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于雄鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)入雌鼠體內(nèi)后，可被誘導(dǎo)分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并形成子宮內(nèi)膜組織，使得懷孕率明顯提高[21]。然而另外的研究發(fā)現(xiàn)，在移植干細(xì)胞并得到修復(fù)的受損子宮中，僅能檢測(cè)到低于0.01%干細(xì)胞存在，提示干細(xì)胞的移植數(shù)量及體內(nèi)增殖可能并不是修復(fù)的主要手段[3]。Santamaria等[22]將自體來(lái)源的CD133+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植至子宮受損患者體內(nèi)，通過(guò)對(duì)術(shù)后6個(gè)月的子宮內(nèi)膜厚度、宮腔粘附狀態(tài)、血管再生及懷孕狀態(tài)評(píng)估，所有患者的子宮狀態(tài)均得到良好改善，半數(shù)患者甚至恢復(fù)到受損前狀態(tài)，多名患者自然受孕，胚胎移植成功率高達(dá)50%。王燕華等[23]將帶EGFP標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞移植至受損的小鼠子宮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞定植于損傷側(cè)子宮，后續(xù)子宮形態(tài)恢復(fù)較好，且嚴(yán)重纖維化發(fā)生例數(shù)減少，但存在成瘤風(fēng)險(xiǎn)。Corradetti等[24]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于羊膜的間充質(zhì)干細(xì)胞與子宮來(lái)源的細(xì)胞擁有大量重疊的基因表達(dá)譜，而且體外共培養(yǎng)時(shí)，子宮來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞增殖速度明顯增加。Xu等[25]注射復(fù)合膠原支架的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞于已建立好的大鼠子宮瘢痕模型中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)合移植組有明顯的膠原降解，修復(fù)后妊娠率也明顯高于對(duì)照組。然而，細(xì)胞來(lái)源不同，移植方式不同，細(xì)胞的歸巢效率是不一樣的，干細(xì)胞歸巢是其發(fā)揮修復(fù)作用的重要前提[26]。因此選擇合適的細(xì)胞來(lái)源、恰當(dāng)?shù)囊浦矔r(shí)機(jī)、移植位置、移植劑量都非常重要。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞存在于基底層與肌層的連接處，不僅擁有干細(xì)胞共有的高效增殖速率和多能分化特性，且獲得方式較為容易，無(wú)倫理學(xué)困擾，獨(dú)有的定位優(yōu)勢(shì)和低免疫原性也使之成為子宮組織損傷修復(fù)當(dāng)仁不讓的首選。

本實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)驗(yàn)室已培養(yǎng)鑒定好的小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的第五代進(jìn)行干細(xì)胞移植，PBS注射作為模型對(duì)照組。考慮到開(kāi)腹手術(shù)對(duì)鼠體本身健康的傷害，本實(shí)驗(yàn)選擇將懸浮好的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞于損傷當(dāng)時(shí)移植進(jìn)入受損子宮，對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，并在術(shù)后第3天通過(guò)尾靜脈再次注射干細(xì)胞，以期增加歸巢干細(xì)胞數(shù)，提高修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植組子宮內(nèi)膜厚度明顯增加，上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，數(shù)量增多，腺體豐富。同時(shí)，我們選擇免疫組化檢測(cè)CK、Vim、VEGF、ERα四種蛋白，通過(guò)其表達(dá)量的變化來(lái)進(jìn)一步明確修復(fù)程度。臨床顯示子宮內(nèi)膜薄通常表現(xiàn)為腺上皮生長(zhǎng)緩慢，動(dòng)脈血流阻力增高[27]。角蛋白作為上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，主要表達(dá)于腺上皮和腔上皮細(xì)胞[28]。角蛋白的高表達(dá)，意味著上皮細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)完整。因此在子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中，修復(fù)組相比損傷組的角蛋白表達(dá)上調(diào)，修復(fù)組隨著時(shí)間延長(zhǎng)角蛋白表達(dá)不斷增加，無(wú)一不在提示著上皮細(xì)胞的良好再生。波形蛋白主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性維持有著非常關(guān)鍵的作用[29]。修復(fù)組波形蛋白表達(dá)上調(diào)，意味著受損子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的有效增殖。VEGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在血管通透性的調(diào)整，新生血管的形成和維護(hù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[30]。子宮內(nèi)膜受損導(dǎo)致動(dòng)脈血流阻力加大，VEGF的表達(dá)下降，而VEGF表達(dá)上調(diào)，則意味著血管生成得到改善，血流通暢，最終誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜增殖，狀態(tài)改善。通常認(rèn)為，雌激素受體主要分為ERα和ERβ兩種，其中主要存在于生殖系統(tǒng)中與雌激素作用的受體是ERα，二者相互作用介導(dǎo)下游相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄從而影響子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)發(fā)育[31]。雌激素受體表達(dá)的上升或下降，指示著子宮內(nèi)膜的增生與蛻膜化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種蛋白均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，說(shuō)明子宮內(nèi)膜確實(shí)得到了修復(fù)，并且在7 d到14 d中間，出現(xiàn)了較高的增長(zhǎng)，是一個(gè)非常有意義的指征。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)后較好，干細(xì)胞移植組雖然與空白對(duì)照組相比尚有差距，但相對(duì)模型對(duì)照組來(lái)說(shuō)，已有了明確的改善。但本研究沒(méi)有對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，從而進(jìn)一步跟蹤子宮間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)的歸巢情況，進(jìn)而探索子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)的機(jī)制，是本實(shí)驗(yàn)的局限。希望通過(guò)后續(xù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步完善及深入，明確修復(fù)機(jī)理，進(jìn)一步提升修復(fù)效果，為臨床子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的使用及薄型子宮的治療打下夯實(shí)的基礎(chǔ)。