楊 蓮 高 歡 吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

番茄（Solanum lycopersicum）喜溫，生長最適宜溫度為20～30 ℃，對低溫敏感，是典型的冷敏感植物（郭文英，2006）。在我國北方地區(qū)設(shè)施番茄節(jié)能栽培中，由于日光溫室設(shè)施結(jié)構(gòu)比較簡陋以及加溫設(shè)備不完善，冬春季節(jié)常遭遇晝/夜溫度低于20/12 ℃的亞低溫脅迫（白龍強(qiáng) 等，2016）。短期亞低溫對植物生長影響較小，但實際冬春反季節(jié)栽培中蔬菜常遭遇長期亞低溫脅迫，導(dǎo)致生長發(fā)育不良、落花落果，嚴(yán)重影響品質(zhì)和產(chǎn)量（李建明 等，2016）。亞低溫環(huán)境下植物各種代謝活動受阻（李俊 等，2012），抑制植株生長，根系生長不良，根系活力降低從而導(dǎo)致養(yǎng)分吸收量減少（劉玉鳳 等，2017）。光合作用對低溫脅迫非常敏感（劉春英 等，2012；Liu et al.，2016），低溫導(dǎo)致葉綠素降解，光合機(jī)構(gòu)遭到破壞，最終導(dǎo)致光合能力下降（Abram et al.，2007；武威 等，2014）。鉀是植物光合作用過程中不可或缺的重要元素之一，能活化光合作用關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)光合作用，提高植物的抗寒性（潘瑞熾，2004）。溫度影響植株根部對K+的吸收（Bravo & Uribe，1981；Siddiqi et al.，1984）以及K+在各器官中的分配（Yan et al.，2012），有研究表明亞低溫降低了番茄幼苗各器官的K+含量（徐菲 等，2013）。

近年來有關(guān)外源物質(zhì)緩解亞低溫脅迫的研究大多集中在光合與抗氧化等生理指標(biāo)上，例如，亞低溫脅迫下外源赤霉素（GA）通過提高光系統(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)活性，增強(qiáng)CO2同化能力，促進(jìn)黃瓜幼苗生長（白龍強(qiáng) 等，2016）。亞適宜溫度下外源施用葉綠酸鐵可以促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，降低丙二醛（MDA）含量，從而減輕黃瓜受到的亞低溫傷害（張蒙 等，2014）。外源噴施硝酸鈣能顯著緩解夜間亞低溫對薄皮甜瓜生長的抑制作用，提高保護(hù)酶活性，降低活性氧產(chǎn)生速率，增強(qiáng)甜瓜植株的抗寒性（李天來 等，2011）。

24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）又稱蕓苔素內(nèi)酯，是一種新型甾醇類植物激素，廣泛存在于植物界，參與植物生理代謝和生長發(fā)育過程，被稱為第六大植物激素（Divi & Krishna，2009）。EBR 還在植物抵御弱光（李蒙 等，2019）、高溫（吳雪霞 等，2013）和低溫（李淑葉 等，2018）等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，EBR 在緩解低溫脅迫上有很好的作用。EBR 通過調(diào)節(jié)碳同化和抗氧化代謝，增強(qiáng)了番茄（束勝 等，2016）、黃瓜（吳秀和陸曉民，2015）對亞低溫脅迫的耐受性。有關(guān)亞低溫條件下EBR 對番茄鉀吸收以及相關(guān)基因表達(dá)的影響鮮有研究。本試驗以2 個耐寒性不同的番茄品種為試驗材料，研究亞低溫脅迫下外源EBR對番茄生長和鉀吸收的影響，以期為冬春季設(shè)施番茄栽培中24-表油菜素內(nèi)酯的施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018 年3—5 有在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝設(shè)施工程中心節(jié)能日光溫室和園藝園林學(xué)院蔬菜生理生態(tài)研究室（45°41′N，126°37′E）進(jìn)行。供試番茄品種為低溫敏感型品種東農(nóng)708（DN 708）和耐低溫型品種東農(nóng)722（DN 722），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。番茄種子經(jīng)消毒、浸種后于28 ℃培養(yǎng)箱中催芽，70%種子露白后播于育苗盤中，待幼苗兩葉一心時分苗于裝有基質(zhì)（蛭石∶珍珠巖=2V∶1V）的營養(yǎng)缽中，每缽1 株，每3 d 澆灌1次半劑量改良的Hogland 營養(yǎng)液，每缽澆100 mL。

1.2 試驗方法

采用盆栽試驗，番茄幼苗長至四葉一心時，挑選整齊一致的幼苗放入溫度25 ℃/18 ℃（晝/夜）、光照強(qiáng)度12 000 lx、光周期16 h/8 h（晝/夜）、相對濕度60%的人工氣候箱中適應(yīng)2 d 后進(jìn)行處理。試驗以適溫25 ℃/ 18 ℃（晝/夜）為對照，亞低溫處理溫度為15 ℃/10 ℃（晝/夜），2 個番茄品種各設(shè)3 個處理：對照、亞低溫處理、亞低溫下施用24-表油菜素內(nèi)酯處理（外源EBR 處理）。每個處理30 株，3 次重復(fù)，外源EBR 處理的植株每天20：00 葉面噴施濃度為0.1 μmol·L-1的EBR（葉片正面和背面均附著水珠為止），對照和亞低溫處理的植株噴施等量蒸餾水，噴施10 d 后進(jìn)行取樣。

1.3 項目測定

1.3.1 株高與干質(zhì)量的測定 每個處理隨機(jī)選取6株幼苗，洗凈后吸干水，用直尺測量株高；然后置于105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min，65 ℃烘干至恒重，用電子天平稱量干質(zhì)量。

1.3.2 丙二醛含量、電解質(zhì)滲透率和光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率的測定 丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法（王學(xué)奎和黃見良，2015）；電解質(zhì)滲透率測定參照Ishitani 等（1998）的方法略有改動；光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）測定參考楊萬基等（2017）的方法。

1.3.3 K+濃度的測定 植株各部分樣品烘干后粉碎，過0.3 mm 篩，用濃H2SO4消煮，然后采用火焰光度法測定植株根、莖、葉中K+濃度。

1.3.4 K+通道蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)的測定用Trizol 試劑提取番茄葉片與根系總RNA。質(zhì)量合格的RNA 采用BioTeke（百泰克生物技術(shù)有限公司）的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用Primer 5.0軟件設(shè)計基因特異引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以番茄actin基因（Lovdal & Lillo，2009）為內(nèi)參基因，在實時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。定量檢測反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。每個樣品3 次重復(fù)，基因表達(dá)水平采用2-ΔΔct法進(jìn)行計算。

表1 qRT-PCR 基因特異性引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 軟件處理原始數(shù)據(jù)，利用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，方差分析采用Tukey’s HSD 在P＜0.05 水平下進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄幼苗生長的影響

由圖1 可知，亞低溫處理顯著降低了2 個番茄品種幼苗的株高與干質(zhì)量，與對照相比，低溫敏感型番茄品種DN 708 的株高與干質(zhì)量分別降低了50.40%和19.87%，降幅大于耐低溫型番茄品種DN 722（44.52%和17.71%）。與亞低溫處理相比，外源EBR 處理顯著提高了2 個番茄品種幼苗的株高與干質(zhì)量，DN 708 的株高與干質(zhì)量分別增加了31.87%和13.31%，增幅大于DN 722（15.58%和9.98%）。2 個品種間進(jìn)行比較，DN 722 亞低溫處理與外源EBR 處理的干質(zhì)量均顯著高于DN 708。

2.2 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄幼苗MDA 含量、電解質(zhì)滲漏率與光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率的影響

如圖2 所示，與對照相比，亞低溫處理的2 個番茄品種幼苗葉片MDA 含量和電解質(zhì)滲漏率顯著提高，光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）顯著降低，DN 708 的變化幅度高于DN 722。與亞低溫處理相比，外源EBR 處理顯著降低了2 個番茄品種幼苗MDA 含量和電解質(zhì)滲漏率，顯著提高了Fv/Fm，其中DN 708 幼苗的MDA 含量和電解質(zhì)滲漏率分別降低了22.85%和28.32%，F(xiàn)v/Fm提高了24.36%，變化幅度高于DN 722（18.58%，22.99%和17.11%）。表明亞低溫脅迫下葉面噴施EBR 溶液對DN 708 植株冷損傷的緩解效果大于DN 722。

2.3 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄各器官K+濃度的影響

由表2 可知，亞低溫脅迫下2 個番茄品種根中K+濃度顯著增加，莖和葉中顯著減少，DN 708莖和葉中K+濃度顯著低于DN 722。與對照相比，DN 708 根中K+濃度增加54.71%，莖和葉中分別減少16.75%和30.28%；DN 722 根中K+濃度增加64.11%，莖和葉中分別減少12.00%和18.14%。與亞低溫處理相比，外源EBR 處理顯著增加了2 個番茄品種各器官K+濃度，DN 708 根、莖和葉中K+濃度分別增加16.84%、6.59%和15.17%，DN 722分別增加12.87%、6.33%和11.29%，DN 708 的增加幅度大于DN 722。

表2 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄各器官K+濃度的影響 mg·g-1

2.4 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄幼苗鉀素吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄幼苗K+通道蛋白基因LKT1相對表達(dá)量的影響 如圖3 所示，與對照相比，亞低溫處理顯著提高了DN 708 和DN 722 根中LKT1基因的相對表達(dá)量（圖3-a），顯著降低了葉中LKT1基因的相對表達(dá)量（圖3-b）；2 個品種間進(jìn)行比較，DN 708 葉中LKT1基因的相對表達(dá)量顯著低于DN 722。與亞低溫處理相比，外源EBR 處理顯著提高了2 個番茄品種根和葉中LKT1基因的表達(dá)，DN 708 根和葉中LKT1基因的相對表達(dá)量分別提高了70.94%和110.83%，增幅大于DN 722（66.78%和94.85%），由此可見，亞低溫脅迫下葉面噴施EBR 溶液對DN 708 植株中LKT1基因相對表達(dá)的促進(jìn)作用更大。

2.4.2 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄幼苗K+轉(zhuǎn)運蛋白基因SIHAK5相對表達(dá)量的影響 由圖4可以看出，亞低溫處理下DN 708 和DN 722 根中SIHAK5基因的相對表達(dá)量顯著高于對照（圖4-a），葉中SIHAK5基因的相對表達(dá)量顯著低于對照（圖4-b）。與亞低溫處理相比，外源EBR 處理的2 個番茄品種根和葉中SIHAK5基因的相對表達(dá)量均顯著增加，根中分別增加了110.50%和88.43%；葉中分別增加了161.76%和144.04%，DN 708 的增加幅度大于DN 722。2 個品種間進(jìn)行比較，DN 722 亞低溫處理與外源EBR 處理的番茄葉片中SIHAK5基因的相對表達(dá)量均顯著高于DN 708。

2.4.3 外源EBR 對亞低溫脅迫下番茄幼苗K+轉(zhuǎn)運蛋白基因SIHAK9相對表達(dá)量的影響 由圖5 可知，與對照相比，亞低溫處理顯著增加了DN 708和DN 722 根中SIHAK9基因的相對表達(dá)量（圖5-a），顯著降低了葉中SIHAK9基因的相對表達(dá)量（圖5-b）。與亞低溫處理相比，外源EBR 處理顯著提高了2 個番茄品種根和葉中SIHAK9基因的相對表達(dá)量，DN 708 根和葉中SIHAK9基因的相對表達(dá)量分別增加了68.90%和474.31%，增幅大于DN 722（44.45%和176.34%）。

3 討論與結(jié)論

番茄是冷敏感作物，當(dāng)溫度低于15 ℃就會導(dǎo)致其生長發(fā)育不良（朱龍英 等，1998）。干物質(zhì)是植物體內(nèi)的有機(jī)物在充分干燥后的質(zhì)量，是衡量植物營養(yǎng)成分的一個重要指標(biāo)，植物干物質(zhì)的積累涉及植株生長、光合作用的能力及同化產(chǎn)物運輸?shù)纫幌盗械纳砩^程（李俊，2013）。本試驗結(jié)果表明，亞低溫脅迫下2 個番茄品種幼苗株高和干質(zhì)量顯著下降，其中DN 708 的下降幅度大于DN 722，表明低溫敏感型番茄品種東農(nóng)708 生長受抑制的程度明顯高于耐低溫型番茄品種東農(nóng)722，與高歡等（2018）的研究結(jié)果一致。24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）是一種有效的激素類物質(zhì)，在植物體內(nèi)廣泛分布，其含量的微小變化都會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生較大的影響（李程 等，2015）。本試驗中，葉面噴施EBR 溶液能有效緩解亞低溫脅迫下2 個番茄品種幼苗株高和干質(zhì)量的下降，并且EBR對亞低溫脅迫下DN 708 株高的緩解效果大于DN 722，這可能是由于不同番茄品種對EBR 的適應(yīng)性不同。

植物膜系統(tǒng)是植物遭受冷害的最敏感部位，低溫脅迫環(huán)境下植物細(xì)胞膜被破壞，膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，細(xì)胞電導(dǎo)率增大（李淑葉等，2018），同時，活性氧產(chǎn)生和清除的平衡被破壞，葉片發(fā)生膜脂過氧化作用，導(dǎo)致MDA 含量增加（李淑葉 等，2010）。本試驗結(jié)果表明，亞低溫脅迫下2 個番茄品種幼苗的MDA 含量和電解質(zhì)滲透率顯著升高，其中DN 708 的增幅大于DN 722，表明DN 708 膜損傷更嚴(yán)重；而外源噴施EBR 顯著降低了2 個番茄品種幼苗葉片MDA 含量和電解質(zhì)滲透率，且DN 708 的降低幅度較大，說明EBR能減輕亞低溫脅迫下番茄葉片膜脂過氧化程度，緩解細(xì)胞膜損傷，增強(qiáng)番茄植株在亞低溫脅迫下的抗性，這與孫玉珺等（2019）在玉米上的研究結(jié)果一致。植物的生長離不開光合作用，低溫可直接影響植物光合器官的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響光合作用（Smillie & Hetherington，1984）。Fv/Fm是 反 映 光系統(tǒng)Ⅱ活性的重要指標(biāo)，能夠表征植物受到的光抑制程度（周建 等，2009）。低溫弱光脅迫條件下西葫蘆Fv/Fm降低，光合作用受抑制，但耐低溫弱光性強(qiáng)的品種Fv/Fm高于其他品種（劉栓桃 等，2009），本試驗結(jié)果與之相似，亞低溫脅迫下DN 722 的Fv/Fm顯著大于DN 708，說明其在低溫下仍能保持較高的光合效率，且外源噴施EBR 能顯著提高2 個番茄品種植株的Fv/Fm，表明EBR 可以通過緩解番茄受到的光抑制，維持光合作用的正常進(jìn)行，有助于番茄植株生長。

鉀是植物必需的營養(yǎng)元素，在酶激活、蛋白質(zhì)合成、滲透調(diào)節(jié)、光合作用、氣孔運動、能量轉(zhuǎn)移、陽離子-陰離子平衡和抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用（Marschner，2012）。組織中高濃度的K+有助于提高植株的抗逆性（Wang et al.，2013），有研究表明在冬季番茄設(shè)施栽培過程中施用鉀肥，能增強(qiáng)番茄植株耐寒性，幫助植株越冬，從而提高番茄產(chǎn)量（郭熙盛 等，1999）。本試驗發(fā)現(xiàn)，亞低溫條件下2 個番茄品種幼苗根中K+濃度顯著升高，與任志雨等（2003）在黃瓜上的研究結(jié)果一致，這可能是番茄的自我保護(hù)機(jī)制，亞低溫脅迫下番茄根系從土壤中吸收更多的鉀來抵御逆境；莖和葉中K+濃度顯著降低，可能是由于亞低溫抑制了K+從地下部向地上部器官轉(zhuǎn)運，2 個品種的根中K+濃度無顯著差異，而莖和葉中的K+濃度DN 722 顯著高于DN 708，這可能是由于亞低溫脅迫下耐低溫型番茄的K+遷移能力大于低溫敏感型番茄，葉片中積累更多K+來抵御亞低溫逆境。而外源噴施EBR顯著增加了番茄幼苗根、莖和葉中K+濃度，K+濃度的增加有利于植物光合同化產(chǎn)物的積累（Waraich et al.，2011），表明外源EBR 處理的番茄植株中更高濃度的K+有利于番茄植株的生長。

植物體內(nèi)K+吸收和轉(zhuǎn)運主要依靠K+通道與K+轉(zhuǎn)運蛋白，番茄中的K+通道基因LKT1是內(nèi)流型K+通道基因，與擬南芥AKT1基因高度同源。研究表明低鉀脅迫下，提高擬南芥AKT1 通道蛋白活性，能增強(qiáng)擬南芥K+吸收能力（Xu et al.，2006）。植物體內(nèi)的K+轉(zhuǎn)運蛋白不僅在植物K+吸收轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，還參與植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。KT/HAK/KUP 家族是重要的K+轉(zhuǎn)運蛋白家族（Ahn et al.，2004），擬南芥HAK5基因主要在植株從外界吸K+過程中發(fā)揮重要作用（Pyo et al.，2010），AtHKT1、HAK6以 及HAK11參與植物對鹽脅迫的響應(yīng)，從而增強(qiáng)植物的抗鹽性（Maathuis，2006）。SIHAK5、SIHAK9屬 于 番 茄KT/HAK/KUP 家族中的K+轉(zhuǎn)運體，其中SIHAK9在番茄的根部與幼葉中均有較高的表達(dá)量，在植株生長發(fā)育、礦質(zhì)營養(yǎng)平衡與脅迫適應(yīng)的過程中均起到重要的作用（Hyun et al.，2014）。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫脅迫誘導(dǎo)了K+通道基因LKT1、K+轉(zhuǎn)運基因SIHAK5、SIHAK9在2 個番茄品種根中的表達(dá)，但抑制了在葉中的表達(dá)，這一結(jié)果表明，亞低溫脅迫下番茄幼苗可能通過提高根系中K+吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)根系從土壤中吸收K+，從而增加了根系中K+濃度，增強(qiáng)植株耐冷性；同時抑制了K+向葉片中的轉(zhuǎn)運，從而導(dǎo)致葉片中的K+含量下降。亞低溫脅迫下外源EBR 處理提高了2 個番茄品種根與葉中LKT1和SIHAK5基因的表達(dá)，這可能是各器官中K+濃度增加的主要原因，但是亞低溫脅迫下外源EBR 如何調(diào)節(jié)番茄鉀吸收轉(zhuǎn)運機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，亞低溫條件下外源24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）可通過緩解植物膜損傷，減輕膜脂過氧化程度，促進(jìn)K+吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)，增加番茄各器官中K+濃度來提高番茄幼苗對亞低溫脅迫的耐受性，但耐冷性不同的番茄品種對EBR的適應(yīng)性存在差異，EBR 對低溫敏感型番茄品種東農(nóng)708 的作用效果大于耐低溫型番茄品種東農(nóng)722。