毛群穎，高帆，賀鵬飛，梁爭論，徐苗

中國食品藥品檢定研究院，北京102629

2020 年10 月23 日，《世界衛(wèi)生組織腸道病毒71 型滅活疫苗的質量、安全性及有效性指導原則》（以下簡稱指導原則）經生物制品標準化專家委員會（Expert Committeeon Biological Standardization，ECBS）審議通過。該指導原則的通過對全球重癥手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）疫情的防控及我國腸道病毒 71 型（enterovirus 71，EV71）疫苗申請世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）預認證，進入聯(lián)合國疫苗采購清單，促進我國EV71疫苗走進國際市場至關重要。同時也是我國成為WHO 生物制品標準化和評價合作中心以來，對WHO 疫苗標準制訂方面的重要貢獻。簡要介紹該指導性文件的制訂背景和主要內容對我國更多參與國際標準制訂、更好理解和應用該指導原則，提升我國疫苗研發(fā)、生產和質控理念，促進疫苗國際化具有重要意義。因此，本文針對該指導原則的起草背景、中國的技術支撐及重點內容作一介紹。

EV71 滅活疫苗的質量、安全性及有效性指導原則是WHO 為確保EV71 疫苗的質量及安全、有效而制訂的，旨在為全球監(jiān)管機構及疫苗生產企業(yè)提供的關于EV71 滅活疫苗生產過程、質量控制、非臨床評價和臨床評價的指導性文件。為促進全球重癥HFMD 的防控和EV71 疫苗的研發(fā)、生產和應用，2020年WHO 在第72 屆ECBS 會上審議通過了第一部WHO EV71 滅活疫苗質量、安全性及有效性指導原則。該指導原則的制訂是由WHO 組織來自全球學術界、國家監(jiān)管當局、國家控制實驗室及疫苗研發(fā)與生產企業(yè)的相關專家，根據中國已獲批上市的3 種EV71 疫苗、候選 EV71 疫苗［1-9］及其他滅活病毒疫苗［如滅活脊髓灰質炎疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine，IPV）］與甲型肝炎疫苗［10-11］的經驗提出。

由于目前重組類及其他類型的EV71 疫苗或EV71-CA16 二價疫苗等均處于研發(fā)早期階段，該指導原則僅適用于以哺乳動物細胞培養(yǎng)、采用甲醛或其他化學滅活劑制備的EV71 全病毒滅活疫苗。同時應結合現行WHO 關于疫苗非臨床評價［12］、臨床評價［13］、生物制品生產質量管理規(guī)范（GMP）［14］、細胞庫［15］、疫苗佐劑和含佐劑疫苗的非臨床評價［16］及批簽發(fā)［17］等指導原則。

1 起草背景

EV71 除可引起輕癥HFMD 外，還可導致患兒出現腦干腦炎、無菌性腦膜炎、急性脊髓炎、急性小腦共濟失調、神經源性肺水腫和心肺衰竭等重癥疾病，是導致我國乃至全球重癥HFMD 的主要病原體。重癥患兒具有起病急、病程進展迅速、病死率高、可導致認知障礙等神經系統(tǒng)后遺癥的特點［18］。自1969 年首個EV71 在美國成功分離以來［19］，全球均有流行或暴發(fā)報道［20-25］。1998 年，中國臺灣地區(qū)暴發(fā)EV71 流行，共有405 例重癥病例入院治療，死亡 78 例［26］。中國大陸自 2008 — 2015 年，共報道1 381 萬例報告病例，死亡3 342 例，占中國大陸丙類傳染病總死亡人數的90.3%［27］。另外，馬來西亞、新加坡、緬甸、日本、和越南等國家均有重癥病例和死亡病例的報道［21-25］。EV71 感染在亞太地區(qū)呈發(fā)病率高、流行范圍廣、重癥和病死人數增多的流行特征。除亞太地區(qū)外，EV71 引發(fā)的HFMD 在非洲、歐洲和美洲等地區(qū)也有散發(fā)或小規(guī)模暴發(fā)流行。美國、英國、加拿大、新西蘭、挪威等國家均有HFMD 流行的報道，其中美國和英國出現了重癥和死亡病例［28］。EV71 已成為后脊髓灰質炎時代最嚴重的噬神經系統(tǒng)腸道病毒。

EV71 滅活疫苗是我國自主研制的、全球唯一可預防EV71 重癥HFMD 的新型疫苗［29］。該疫苗是采用病毒培養(yǎng)、純化、滅活和佐劑吸附工藝生產的全病毒滅活疫苗，經3 萬余名嬰幼兒臨床試驗證實，疫苗保護效果均達90%以上，且安全性良好［1-3］。2015年12 月，分別由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所、北京科興生物制品有限公司和武漢生物制品研究所有限責任公司生產的3 個滅活疫苗產品先后在我國獲批上市。目前已對我國31 省、直轄市和自治區(qū)的4 000 余萬名嬰幼兒接種使用，我國HFMD 死亡人數顯著下降，至2018 及2019 年已較疫苗上市前的平均死亡人數下降了92.7%和95.8%［27］，有效控制了我國的EV71 疫情。

在該背景下，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）專家和WHO 專家充分溝通，建議WHO 制訂 EV71 疫苗指導原則，對促進全球EV71 疫苗研發(fā)、生產、應用及評價，確保全球受EV71 威脅的嬰幼兒可獲得安全、有效的疫苗進行防護具有重要意義。

2 中國EV71 疫苗質量研究對WHO 指導原則制訂的技術支撐作用

2.1 中國EV71 疫苗質控平臺的建立 EV71 疫苗是在中國國家重大專項重點支撐下，集產、學、研、檢為一體集成研發(fā)創(chuàng)建的具有我國自主知識產權的新型疫苗。為確保疫苗研發(fā)、生產和質控水平，中檢院在疫苗研發(fā)早期即開展了EV71 疫苗流行病學、免疫原性、動物模型建立及交叉保護等研究，揭示了EV71 血清流行病學特性、EV71 疫苗免疫原性和交叉保護效果，為該疫苗研發(fā)和評價奠定了基礎［30-36］。同時，為創(chuàng)建EV71 疫苗質控體系，有效確保EV71疫苗安全、有效和質量可控，與國內同行開展EV71中和抗體檢測方法學［37］，建立了EV71 疫苗國家中和抗體標準品［38］、EV71 疫苗標準檢測毒株［39］、EV71疫苗國家抗原標準品［38］、EV71 疫苗國家效力參考品［40］及中和抗體標準化檢測程序，建立了標準化中和抗體檢測平臺及臨床免疫原性評價平臺，有力支持我國3 家疫苗產品的臨床保護效果評價，推動我國EV71 疫苗的獲批上市［29］。

2.2 國際EV71 標準品的建立 為促進全球EV71疫情防控及我國獨創(chuàng)疫苗走入國際市場。2012 年，應中檢院邀請，WHO 標準物質研制資深單位英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）專程來華就我國的EV71 疫苗研發(fā)和質量控制研究首次進行了深入溝通交流，并得到NIBSC 高度認可，于當年即向WHO遞交了合作開展EV71 國際標準品研制的申請并獲批。2013 年，中檢院與NIBSC 正式簽署了EV71 國際標準研制合作意向書，開啟了EV71 疫苗國際標準的研究歷程。隨后，在雙方科學家的共同努力下，針對國際標準物質及其他關鍵問題，收集全球9 個基因亞型的EV71，建立了多基因型EV71 病毒庫；采用具有高中和活性和廣譜交叉能力的單抗，建立EV71國際通用抗原檢測試劑，先后解決了EV71 中和抗體交叉保護、EV71 抗原特性評價及候選標準物質篩選等關鍵問題，完成了候選標準品的制備，最終經國際協(xié)作標定證實候選標準品可顯著降低實驗室檢測誤差，有效保證EV71 疫苗質控、評價的準確性、重復性和可比性。2015 和2019 年成功研制了第1 代EV71 中和抗體國際標準品（14 ／ 140）、第 1 代 EV71中和抗體國際參考品（13 ／ 238）［41-43］、第 1 代 EV71疫苗國際標準品（18 ／ 116）、第 1 代 C4 型和 B4 型EV71 疫苗國際參考品（18 ／ 120 和 18 ／ 156）［44-45］，上述相關研究不但填補了EV71 國際標準研制的空白，且開創(chuàng)了我國主導研制國際生物制品標準品的先河。同時，系列國際標準品和參考品的建立，也為WHO 指導原則的制訂奠定了基礎。

2.3 中國質量控制和評價技術要點的發(fā)布 為促進WHO 指導原則的制訂，2016 年中檢院組織制訂和發(fā)布了我國首部《EV71 疫苗質量控制和評價技術要點》［46］。在該技術要點中重點關注EV71 疫苗生產的質控和評價，強調生產全過程的一致性，明確標準物質和趨勢分析，提出了風險前置等質控理念。該技術要點的頒布不但進一步規(guī)范了我國EV71 疫苗的生產和質控，確保我國上市疫苗的質量安全穩(wěn)定、可靠，同時也為WHO 指導原則的制訂提供了初稿，有力推動了WHO 指導原則的制訂。

3 WHO EV71 疫苗指導原則的制訂

2016 年我國首次在WHO ECBS 會議上提出了制訂EV71 滅活疫苗的質量、安全性及有效性指導原則的建議。并于2017 和2018 年，先后組織召開了中日韓第三屆疫苗研究及質量控制研討會和第四屆WHO 疫苗標準化和監(jiān)管評價合作中心國際會議，利用這兩個國際會議平臺，將《EV71 疫苗質量控制和評價技術要點》提請國際專家討論，并初步探討EV71 滅活疫苗WHO 指導原則的框架和主體內容。通過與WHO 及國際專家的多次溝通討論，最終推動WHO 于2019 年在我國上海召開了“腸道病毒71 型（EV71）滅活疫苗的質量、安全性及有效性指導原則制訂工作會議”，會議確立了指導原則的編寫原則和方案，成立由我國包括王軍志院士等7 名國際權威專家構成的指南起草專家組，正式啟動該指導原則的編寫和制訂工作。在起草專家組及國內外業(yè)內專家的共同努力下，2020 年4 月該指導原則的編寫工作順利完成。經1 個月公開征求意見，2020 年7 月在綜合全球專家意見和建議的基礎上，形成了最終版并遞交 ECBS 審評（WHO ／ BS2020.2388）［47］。2020 年 10 月 19 — 23 日，由包括 ECBS 專家委員、顧問、國際組織代表及WHO 專家和各國監(jiān)管部門代表等100 余位專家，對該指導原則再次進行了逐條討論后，第一部《世界衛(wèi)生組織腸道病毒71 型滅活疫苗的質量、安全性及有效性指導原則》順利通過第72 屆WHO ECBS 會議審議，為確保全球EV71 疫苗的質量、安全和有效性提供了指導原則。

4 WHO EV71 疫苗指導原則的要點簡介

該指導原則主要包括EV71 疫苗的生產制造、非臨床評價、臨床評價及對國家監(jiān)管機構（National Regulatory Authorities，NRAs）的指導建議 4 個部分。以下對指導原則的主要內容和制訂過程中專家關注和討論的焦點問題作一介紹。

4.1 生產制造 本部分主要介紹了從細胞庫和種子批到EV71 疫苗培養(yǎng)、純化、滅活及配置的全過程和質量控制，其中著重關注安全性和有效性。

4.1.1 病毒滅活 為確保疫苗安全性，生產企業(yè)應建立良好的純化、滅活程序，以確保病毒完全滅活且無殘留傳染性，并進行充分驗證，保證疫苗安全性。根據IPV 生產工藝經驗建議采用純化、過濾和滅活順序，并對病毒滅活前、滅活中和滅活驗證均提出了詳細要求。

4.1.1.1 病毒滅活前 應進行病毒滴度、抗原含量、比活等檢測；應采用0.22 μm 濾膜進行過濾，以去除顆粒物和其他干擾物質，并在過濾后24 h 內開始病毒滅活，中間間隔時間最長不超過72 h。應保留病毒過濾后滅活前的樣本，進行病毒滴度檢測，以監(jiān)測病毒滅活動力曲線。

4.1.1.2 病毒滅活 滅活方法應證明可持續(xù)滅活EV71，且不破壞病毒抗原活性和免疫原性。滅活過程應監(jiān)測病毒滴度，滅活周期通常應大于使病毒滴度降至檢測不到時間的2 倍。滅活過程中應進行第2 次過濾。滅活動力曲線應至少4 個時間點，以顯示活病毒濃度隨時間的降低情況。應測定滅活前、滅活中和滅活結束時每一個滅活容器的病毒滴度和抗原含量。應至少對5 個連續(xù)批次病毒進行滅活效果和動力學的一致性監(jiān)測。

4.1.1.3 滅活驗證 取樣量應不少于總體積的5%或1 000 劑成品，并接種敏感細胞。接種病毒的稀釋度應不大于1 ／ 4，每毫升樣品應接種不少于3 cm2細胞。如采用甲醛作為滅活劑，則樣品應采用亞硫酸氫鹽中和，透析后檢測。樣品培養(yǎng)時間應不少于21 d，期間至少進行2 次細胞傳代。在滅活驗證同時或結束時，應接種陽性對照（少量的活病毒），以保證檢測方法的靈敏度。在接種后5 ～7 d 內應及早更換培養(yǎng)液，以保證培養(yǎng)液處于良好狀態(tài)。

4.1.2 質量控制 為確保有效性，提出效力試驗應進行體內、體外效力（抗原含量）兩方面檢測。在抗原含量檢測中應采用經驗證的免疫化學方法，并采用經第1 代EV71 疫苗國際標準品標定的標準品檢測。一旦獲得連續(xù)足夠批次的數據證實生產一致性，且證實體內外效力標準具有可比性，則體內效力可省略。如疫苗含有佐劑，應解吸附后再進行檢測。如疫苗中含有其他抗原，則應證明EV71 抗原檢測方法的適用性。如EV71 抗原檢測方法不適用，則應采用體內效力法進行。

4.2 非臨床評價 包括產品特性工藝開發(fā)、免疫原性、動物保護及安全性4 個部分。其中著重強調交叉保護，建議在動物模型中進行交叉攻毒保護研究，以評估對不同基因型或異源病毒的保護力，證明疫苗保護的廣度。

4.3 臨床評價 由于目前研究已獲得充分數據證明EV71 滅活疫苗的保護效果，因此在臨床評價中同樣對交叉保護提出了重點關注，包括疫苗免疫個體對不同基因型、不同毒株的交叉能力及對流行病毒的進化、變異進行監(jiān)測，如果疫苗上市國家出現新的亞種群病毒，需要對潛在的交叉保護能力進行深入的臨床調查。

4.3.1 實驗室檢測 包括血清學檢測和病原檢測，基于目前已建立良好的EV71 中和抗體檢測方法，在血清學檢測中鼓勵開發(fā)高通量檢測方法，同時檢測應采用第1 代EV71 中和抗體國際標準品和國際參考品。在病原檢測中提出由于多種病原可導致HFMD，應采用特異性良好的方法確認病原。

4.3.2 免疫原性 免疫劑量和免疫程序的確立應重點關注免疫前抗體陰性人群，探索獲得良好免疫應答的最小劑量和最短間隔周期。應該關注交叉保護，建議使用系列臨床分離株進行研究，并關注自然感染者。

4.3.3 有效性評價 應在臨床上證明對EV71 所致HFMD 和皰疹性咽峽炎具有明確的保護作用方可獲批上市。疾病的定義建議為一種發(fā)熱伴有口腔黏膜、手、腳或臀部的丘疹或水泡疹的疾病。嚴重病例的定義應參照WHO 所述的神經、呼吸或循環(huán)系統(tǒng)相關并發(fā)癥。EV71 感染的實驗室確認建議當滿足以下一點可確認為EV71 感染：①膀胱 ／ 咽拭子或糞便中EV71 RNA 的檢測陽性；②病毒分離與VP1序列分析證明為EV71；③EV71 IgM 陽性。

4.4 對各國NRAs 的建議 與其他疫苗相近，提出對于一個新產品批準上市，制造商應充分證明新產品的質量一致性；并對生產、質控及可能影響EV71 滅活疫苗質量、安全性或有效性的任何重大變更，均應與NRAs 討論并獲得NRAs 的批準；為保證質量一致性，應采用國際標準品標定國家或工作參考物質等要求。

5 小 結

WHO EV71 疫苗指導原則是為確保EV71 疫苗的質量安全有效，為全球監(jiān)管機構及疫苗生產企業(yè)提供關于EV71 滅活疫苗生產過程、質量控制、非臨床評價和臨床評價的指導性文件。該指導原則是在我國的大力推動下，在完成兩個國際標準品研制的基礎上，主導建立的首個EV71 疫苗國際文字標準。在指導原則制定過程中，國際專家充分尊重國內疫苗研發(fā)和審評審批的成功經驗，同時，融入國際上IPV 和甲肝疫苗等同類疫苗國際標準的先進經驗和國際要求，我國監(jiān)管和研發(fā)專家通過深度參與國際標準的制定，對疫苗國際指南的制定原則有了更深入的了解和把握，對今后疫苗研發(fā)也有很多借鑒意義。該指導原則的制訂不僅為全球EV71 疫苗的研發(fā)、生產、評價及應用提供了基本原則，為促進全球EV71疫情防控提供了關鍵指南，同時還可有力推動我國獨創(chuàng)疫苗走入國際市場，顯著提升了我國生物制品的國際影響力，開創(chuàng)了我國疫苗國家標準向國際標準的升級。

志謝感謝中國食品藥品檢定研究院的王軍志院士和王佑春首席對本研究的特別貢獻