徐詩熒，孫嘉笛，張銀志，紀(jì)劍，孫秀蘭

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214100）

1 食品中的雌激素

雌激素是女性的主要性激素，在調(diào)節(jié)正常生理和各種疾病狀態(tài)中起重要作用[1]，可分為內(nèi)源性雌激素和外源性雌激素[2]。內(nèi)源性雌激素是由體內(nèi)腺體或細(xì)胞分泌的激素，最常見的有雌二醇、雌三醇和雌酮。而外源性雌激素包括合成雌激素、植物雌激素和環(huán)境雌激素。其中，植物雌激素是一種多酚類物質(zhì)，是大豆、水果、蔬菜等食品中含有的天然成分，類似于內(nèi)源性雌激素的結(jié)構(gòu)。環(huán)境雌激素則屬于（endocrine disruptors，EDCs），是天然或合成化合物。該類雌激素通過模仿或阻斷內(nèi)源性激素的作用，影響人體的內(nèi)分泌功能[3-4]。生活中常見的環(huán)境雌激素有氯聯(lián)苯、雙酚A（bisphenol A，BPA）和鄰苯二甲酸鹽[5]。

研究表明，動(dòng)物源食品中有較多的雌激素殘留[6]，其中牛奶和乳制品中是人體雌激素的主要膳食來源，其中含有雌二醇等內(nèi)源性雌激素[7-8]。研究表明，市場(chǎng)上部分商品牛奶中的雌二醇含量達(dá)到5 pg/mL～20 pg/mL[9]，而兒童血清中的雌二醇含量則低于2 pg/mL[10]。因此，長(zhǎng)期攝入含有高雌激素含量的牛奶會(huì)導(dǎo)致兒童性早熟或?qū)Τ扇说膬?nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾[8]。

此外，外源性雌激素也廣泛存在于食品中，蜂王漿、茶、巧克力、咖啡渣[11]中均含有雌激素類化合物。由于豆制品是亞洲國(guó)家飲食中不可缺少的一部分，據(jù)統(tǒng)計(jì)，人體異黃酮的攝入量可達(dá)到15 mg/d～50 mg/d[12]，這可能會(huì)導(dǎo)致男性產(chǎn)生女性化的生理癥狀。玉米赤霉烯酮（zearalen-one，ZEN）和雙酚 A（BPA）是近年來受到廣泛關(guān)注的具有雌激素效應(yīng)的物質(zhì)。ZEN作為非甾體雌激素霉菌毒素，是一種主要的食物污染物[13-14]，具有雌激素干擾毒性。食用被ZEN污染的食物或飼料會(huì)對(duì)人類或動(dòng)物產(chǎn)生有害影響，例如降低生育能力和生殖能力[15]。而BPA作為具有雌激素作用的內(nèi)分泌干擾物，被廣泛用于聚碳酸酯嬰兒瓶和環(huán)氧食品罐中。食用罐裝食品會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)BPA含量增加，從而增加肥胖、糖尿病和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

雖然雌激素有益于預(yù)防阿爾茨海默癥、冠心病以及骨質(zhì)疏松，但也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生許多不良影響。過量攝入雌激素不僅會(huì)干擾固有的激素平衡、增加乳腺癌的發(fā)病率[17]，還會(huì)誘發(fā)免疫介導(dǎo)的疾病[18]。目前，國(guó)際上對(duì)食品中BPA和ZEN的含量有明確的規(guī)定。根據(jù)歐盟2002/72/EC法規(guī)，塑料食品接觸材料中BPA的遷移量為3 mg/kg，其最大理論每日攝入量為50 μg/kg·bw/d，與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定相同。歐盟規(guī)定仔豬日糧中ZEN的最高限量為100 μg/L，而我國(guó)規(guī)定復(fù)合飼料和玉米中ZEN的最高限量為500 μg/L。目前，各國(guó)沒有規(guī)定食品中內(nèi)源性雌激素的標(biāo)準(zhǔn)含量，但商品牛奶中雌激素的水平和人類長(zhǎng)期飲用牛奶對(duì)人體健康的不利影響越來越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。同時(shí)調(diào)查表明，從不同國(guó)家和地區(qū)采集的13種食品補(bǔ)充劑樣品中，在14.8%的非激素補(bǔ)充劑中檢測(cè)到成分列表中未標(biāo)記的類固醇激素成分[19]。因此，檢測(cè)食品中的雌激素有利于保障人體健康，避免雌激素對(duì)人體的不利影響。

2 食品中雌激素的生物學(xué)檢測(cè)方法

免疫分析和儀器分析是現(xiàn)階段檢測(cè)食品中雌激素的主要手段，但由于雌激素結(jié)構(gòu)的多樣性，這兩種方法只能檢測(cè)食品中已知的雌激素，有局限性，而利用雌激素對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物的生物學(xué)效應(yīng)來評(píng)價(jià)不同物質(zhì)的雌激素效應(yīng)可以彌補(bǔ)這一不足。

雌激素通過雌激素信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)其生理功能，其信號(hào)途徑可分為基因組信號(hào)和非基因組信號(hào)，分別由經(jīng)典核受體（estrogen receptor，ER）和G蛋白偶聯(lián)受體（gproteincoupledreceptor，GPER）介導(dǎo)[20]。基因介導(dǎo)的信號(hào)途徑通過經(jīng)典的核受體：ERα和ERβ發(fā)揮作用[21]。雌激素刺激細(xì)胞后，與雌激素受體結(jié)合，誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化，形成二聚體，并直接或間接激活受體轉(zhuǎn)錄域[22]。二聚體可以直接與雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）結(jié)合以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[23]，而在沒有 ERE 序列的情況下，二聚體可以由DNA轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)，間接結(jié)合到轉(zhuǎn)錄域[24]。非基因介導(dǎo)的雌激素信號(hào)途徑，通過GPER和雌激素的結(jié)合，激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），介導(dǎo)雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)錄，引起絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）的激活、cAMP的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣的動(dòng)員[25]。

信號(hào)通路被雌激素激活后，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)育、增殖、遷移和存活等一系列下游事件，從而對(duì)代謝調(diào)節(jié)組織如子宮、脂肪、骨骼肌等產(chǎn)生生理影響[26-28]。例如，雙酚A通過ERα途徑促進(jìn)OVCAR-3細(xì)胞的增殖[29]；雌二醇通過激活GPR30信號(hào)通路增強(qiáng)LSD1的表達(dá)，介導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌的增殖[30]；在ERα陽性MCF-7細(xì)胞中，雌激素激活ERα轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)ΔNp63的表達(dá)，從而誘導(dǎo)整合素β4 的表達(dá)，導(dǎo)致蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）磷酸化，提高細(xì)胞活力和遷移能力[31]。為此，建立了一系列基于雌激素信號(hào)通路的生物檢測(cè)方法，以滿足特異性篩選雌激素效應(yīng)物的需要。

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

雌激素原始的檢測(cè)方法為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其中子宮營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)和魚類內(nèi)分泌干擾試驗(yàn)是我國(guó)環(huán)境中篩選分泌物的常規(guī)方法。子宮營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)被用于檢測(cè)雌激素活性的活性效應(yīng)，被認(rèn)為是檢測(cè)雌激素活性物質(zhì)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[32]。類固醇受體分布在動(dòng)物子宮中，雌激素可通過受體信號(hào)途徑調(diào)節(jié)子宮功能[33]。該方法需要選擇去勢(shì)成年雌性或幼齡雌性嚙齒動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)給藥和稱重，經(jīng)過一段時(shí)間后，剝離動(dòng)物子宮稱重。通過計(jì)算子宮濕重和子宮與體重的比值，篩查樣品中的雌激素。小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)咖啡渣和食品包裝中雙酚A的雌激素效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)咖啡副產(chǎn)物及其主要成分具有雌激素樣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性[34]。趙丕文等[35]利用子宮增重實(shí)驗(yàn)研究淫羊藿等10種中藥的雌激素樣作用，發(fā)現(xiàn)淫羊藿具有一定的植物雌激素活性。

魚類內(nèi)分泌干擾試驗(yàn)是以肝臟產(chǎn)生的卵黃蛋白（yolk protein，VTG）作為生物標(biāo)記物，檢測(cè)外源性雌激素[36-37]。卵黃蛋白原是卵黃蛋白原蛋白的主要成分，在外源性雌激素的刺激下其表達(dá)量會(huì)增加[38]。例如，BPA可通過ER受體介導(dǎo)途徑誘導(dǎo)雄性魚肝臟中VTG的表達(dá)[39]。選擇在試驗(yàn)容器中飼養(yǎng)魚體，并使其暴露于含有化學(xué)物質(zhì)的水體。喂養(yǎng)一定時(shí)間后，取血液或組織進(jìn)行卵黃原蛋白檢測(cè)，以評(píng)價(jià)雌激素活性水平。通過研究雌二醇對(duì)瓦氏黃顙魚產(chǎn)生的的激素效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)雄性瓦氏黃顙對(duì)雌激素較為敏感，可作為外源性雌激素的檢測(cè)模型[40]。除此以外，斑馬魚也被用作雌激素的評(píng)估模型，用于比較不同物質(zhì)的的雌激素效應(yīng)[11]。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雖然是一種可靠的雌激素效應(yīng)篩選方法，但該方法操作復(fù)雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高。為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作。因此，在魚類內(nèi)分泌干擾試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了以原代肝細(xì)胞為模型的體外細(xì)胞檢測(cè)方法。將細(xì)胞暴露于含有受試物的培養(yǎng)基中，用VTG水平評(píng)價(jià)受試物的雌激素活性[41]。該方法需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，分別在基因和蛋白水平上檢測(cè)VTG的表達(dá)水平。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（E-screen）

為了提高檢測(cè)效率，建立了一種基于雌激素樣物質(zhì)對(duì)靶細(xì)胞增殖影響的E-screen方法。許多研究表明，雌激素與雌激素受體結(jié)合后可介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的增殖，如果受試物中含有雌激素作用的物質(zhì)，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的刺激將促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過計(jì)算受試物作用前后的細(xì)胞相對(duì)增殖效應(yīng)值或增值速度來評(píng)價(jià)受試物的雌激素活性[42]。

為更好的模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生理環(huán)境，提高檢測(cè)的可靠性，可在乳腺癌培養(yǎng)體系中加入大鼠肝S9體系。肝S9起到代謝化學(xué)物的作用，使得檢測(cè)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度吻合[43]。E-screen方法可用于檢測(cè)環(huán)境水中的污染物[44]，評(píng)價(jià)中藥提取物和蔬菜提取物[45]。與VTG法相比，E-screen法更敏感，通常結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)確保試驗(yàn)的可靠性[46]。

2.3 生物傳感器

2.3.1 表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器

表面等離子體共振（SPR）是電子在金屬/介質(zhì)界面上產(chǎn)生的強(qiáng)電磁振蕩的現(xiàn)象，由于其對(duì)金屬膜旁材料的敏感折射率而被廣泛應(yīng)用于各種生物傳感器中，SPR反射金屬在倏逝場(chǎng)中的反射指數(shù)（reflection index，RI）的變化與金屬膜另一側(cè)生物分子的密度成正比。因此，SPR無需進(jìn)行任何標(biāo)記，就可以實(shí)時(shí)檢測(cè)金膜表面生物分子的結(jié)合和解離[47]。

基于此技術(shù)，研制了一種無標(biāo)記SPR生物傳感器芯片。以ERα和ERE作為生物特征元件，將其固定在生物芯片的金屬膜上。當(dāng)受試物中含有雌激素時(shí)，雌激素會(huì)迅速形成不穩(wěn)定的ER/ERE復(fù)合物，改變ER與ERE之間的相互作用，通過檢測(cè)結(jié)合效率和絡(luò)合物穩(wěn)定性的差異來評(píng)估雌激素效應(yīng)[48]。同時(shí)，ERα和構(gòu)象敏感肽可直接用于識(shí)別雌激素受體結(jié)合區(qū)的活性構(gòu)象，以檢測(cè)低劑量水平的雌激素[49]。目前，該生物傳感器已應(yīng)用于食品包裝和玉米籽禪中雙酚A的檢測(cè)，檢測(cè)限分別為5.2 pg/mL和7.07 ng/mL[50-51]。

2.3.2 細(xì)胞電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器以生物活性物質(zhì)為生物功能性敏感基元，加入檢測(cè)目標(biāo)物后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器將生物學(xué)變化轉(zhuǎn)化為電學(xué)信號(hào)，借此達(dá)到檢測(cè)目的。而細(xì)胞電化學(xué)是基于生物電化學(xué)的原理，結(jié)合細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析和表征的技術(shù)，揭示外源分子與細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的關(guān)系[52]。

雌激素的電化學(xué)檢測(cè)方法是通過檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中嘌呤引起的電信號(hào)變化來評(píng)估雌激素活性。乳腺癌細(xì)胞在雌激素的刺激下會(huì)產(chǎn)生增殖效應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞中嘌呤的增加[53]。細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)與鳥嘌呤的氧化有關(guān)。鳥嘌呤能迅速通過細(xì)胞膜到達(dá)電極表面，引起電化學(xué)信號(hào)的變化[54]。利用這一原理，可以評(píng)價(jià)不同物質(zhì)的雌激素效應(yīng)，但這種方法并沒有很高的特異性，逐漸被電化學(xué)免疫傳感器取代。

2.3.3 熒光細(xì)胞生物傳感器

以雌激素受體控制的報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)的重組酵母篩選技術(shù)（pecombinant yeast estrogen system，RYES）是近年來被廣泛應(yīng)用于雌激素效應(yīng)的篩選。其原理是將雌激素受體基因、雌激素效應(yīng)元件和編碼β-半乳糖苷酶（lac-z）的基因重組于酵母細(xì)胞[55]。當(dāng)受試物具有雌激素樣作用時(shí)，受試物與雌激素受體結(jié)合，介導(dǎo)雌激素效應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄，從而激活lac-z報(bào)告基因，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，使底物β-d-半乳吡喃糖苷變黃。通過測(cè)量β-半乳糖苷酶的活性，定量檢測(cè)受試物的雌激素效應(yīng)[56]。YES技術(shù)的基礎(chǔ)上，以熒光素酶作為報(bào)告基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ERE的重組HeLa細(xì)胞株，用于檢測(cè)草魚等魚肉中雌激素樣物質(zhì)的含量，E2的加標(biāo)回收率均在75%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.3%～11.6%，具有較高的精密度[57]。

但對(duì)熒光素酶的檢測(cè)需要預(yù)先對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，操作步驟較為復(fù)雜。為此，BOVEE等[58]利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（yEGF）改進(jìn)了YES技術(shù)。以增強(qiáng)型熒光蛋白作為報(bào)告基因法，可以直接測(cè)定熒光蛋白的熒光值，簡(jiǎn)化了操作步驟。該方法檢測(cè)雌二醇的半最大效應(yīng)濃度（EC50）約為0.6 nmol/L，與傳統(tǒng)YES方法的0.2 nmol/L相比更為靈敏[59]。除了酵母細(xì)胞模型，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系也可以作為載體來轉(zhuǎn)移重組基因，其敏感性更高，但與子宮增重試驗(yàn)相關(guān)性較差[60]。曹旭等[61]以雌激素反應(yīng)元件（ERE）及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）為報(bào)告基因轉(zhuǎn)染了乳腺癌細(xì)胞，雌二醇以劑量依賴的方式誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表達(dá)GFP，最大效應(yīng)濃度為 1×10-10mol/L，EC50為 1.5×10-11mol/L。

熒光細(xì)胞生物傳感器可作為動(dòng)物源性食品中雌激素活性水平的快速篩選方法。采用該方法對(duì)4個(gè)城市采集的豬肉、雞肉、牛肉、魚類和雞蛋樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有樣本均具有雌激素活性[62]。除了動(dòng)物源性食品外，食品添加劑、牛奶和啤酒也可以使用該方法評(píng)估雌激素活性[63-64]。

3 生物學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)及不足

目前，檢測(cè)食品中的雌激素含量多采用儀器分析和免疫分析方法，但雌激素的結(jié)構(gòu)多樣，這兩種方法只能檢測(cè)出已知結(jié)構(gòu)的雌激素。同時(shí)，儀器分析前需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理[65]，目標(biāo)分析物需要預(yù)富集，操作復(fù)雜困難。更重要的是，液相、質(zhì)譜等儀器價(jià)格昂貴，受場(chǎng)地限制。而免疫分析法雖然有更高的檢測(cè)效率，但其對(duì)抗體的制備要求較高，不同雌激素的免疫檢測(cè)需要對(duì)應(yīng)的抗原支持，目前還難以完全覆蓋，無法同時(shí)檢測(cè)多種雌激素化合物，限制了雌激素效應(yīng)物質(zhì)的篩選。

基于雌激素效應(yīng)途徑的生物檢測(cè)方法可以檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)的雌激素活性，彌補(bǔ)了儀器分析和免疫分析的不足。具有較高的特異性，可評(píng)價(jià)已知和未知物質(zhì)的雌激素效應(yīng)，不僅可以預(yù)測(cè)單一組分的雌激素效應(yīng)，還能夠評(píng)估混合物的聯(lián)合雌激素活性[66]。但該方法不能實(shí)現(xiàn)單組分的準(zhǔn)確定量，檢測(cè)精度也不如儀器分析和免疫分析。

4 展望

基于對(duì)雌激素的高度特異性，生物檢測(cè)將成為食品中雌激素檢測(cè)的首選。在未來的發(fā)展中，需要提高生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，由于受試物中的化學(xué)物質(zhì)未知，其中可能存在毒素因子，導(dǎo)致假陰性情況。因此，在后續(xù)檢測(cè)中，有必要結(jié)合毒性試驗(yàn)，研究物質(zhì)間相互作用對(duì)雌激素效應(yīng)的影響，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，雌激素分子檢測(cè)與毒性效應(yīng)檢測(cè)結(jié)合，有利于更好的了解食品中雌激素對(duì)人體的影響。以細(xì)胞毒性為基礎(chǔ)建立的雌激素毒性效應(yīng)檢測(cè)，能夠做到對(duì)食品基質(zhì)以及水體中雌激素的定性檢測(cè)。通過檢測(cè)受雌激素特異性調(diào)控的基因或蛋白的表達(dá)量變化，對(duì)樣品中的雌激素含量進(jìn)行檢測(cè)，能夠更全面的評(píng)估雌激素對(duì)人體的生物學(xué)效應(yīng)。

檢測(cè)手段和設(shè)備的便攜化、數(shù)字化也是食品檢測(cè)未來的發(fā)展趨勢(shì)。在生物檢測(cè)分析方法的基礎(chǔ)上，研制雌激素檢測(cè)試劑盒。并在此基礎(chǔ)上，開發(fā)便攜式檢測(cè)設(shè)備，并與移動(dòng)應(yīng)用連接，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。這不僅有利于提高檢測(cè)效率，也能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。此外，雌激素預(yù)測(cè)模型的建立將是雌激素檢測(cè)的關(guān)鍵工作。MANSOURI等[67]建立了協(xié)同雌激素受體活性預(yù)測(cè)項(xiàng)目（collaborative estrogen receptor activity prediction project，CERAPP），以預(yù)測(cè)數(shù)千種化學(xué)品的雌激素受體相關(guān)活性。在沒有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的情況下，該模型可以為試驗(yàn)人員提供缺少的信息，并進(jìn)行有針對(duì)性的試驗(yàn)。因此，雌激素檢測(cè)的數(shù)字化發(fā)展對(duì)食品檢測(cè)具有重要意義。

總的來說，食物中的雌激素會(huì)通過食物鏈進(jìn)入人體，通過雌激素信號(hào)途徑干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，產(chǎn)生不良的生理效應(yīng)。雌激素的生物學(xué)檢測(cè)方法不僅滿足了廣泛篩選食品中雌激素效應(yīng)物質(zhì)的需要，而且具有較好的特異性，彌補(bǔ)了儀器檢測(cè)和免疫檢測(cè)的不足。但其定量分析余儀器分析相比不夠準(zhǔn)確，需要在今后的發(fā)展中加以解決。同時(shí)，生物方法與數(shù)字化相結(jié)合，也有利于推動(dòng)食品檢測(cè)向高效化方向發(fā)展。