郭亞萍，王秀菊，胡亞平，張 金，李勇莉

腰椎退行性病變常見于臨床，是引起下腰痛的重要因素之一[1]。目前，腰椎退行性病變的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)病理學(xué)改變是主要原因[2]。NPCs的減少引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解是椎間盤退行性改變的病理基礎(chǔ)，而NPCs大量凋亡是導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞減少的直接原因[3]。因此尋找能抑制NPCs凋亡及ECM降解的藥物對(duì)于防治椎間盤退行性病變意義重大。小檗堿(berberine，BBR)為季胺類化合物，具有抗感染、改善糖脂代謝及預(yù)防退行性改變等作用[4]。但是，目前鮮見有關(guān)BBR用于治療腰椎退行性病變的研究。該研究探究BBR對(duì)NPCs凋亡及ECM降解的影響及其作用機(jī)制，為開發(fā)對(duì)NPCs具有保護(hù)作用的治療藥物以及BBR的臨床應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5只SDF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量160～180 g，4周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022。

1.2 主要試劑及儀器BBR(云南明鏡亨利制藥有限公司)，bFGF(珠海億勝生物制藥有限公司)，DEME細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Life Technology公司)，胰酶(美國(guó)ScienCell公司)，胎牛血清(美國(guó)ScienCell公司)，TRIzol 試劑盒(美國(guó) Invitrogen 公司)，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾公司)，離心機(jī)(意大利A. L. C 公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)FCMXBD公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，冰凍切片機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Eppendorf公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1NPCs細(xì)胞分離與培養(yǎng) 斷頸處死大鼠后，依據(jù)文獻(xiàn)[5]所述方式采用序貫酶消法分離NPCs，接種于含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，經(jīng)反復(fù)吹打后制成細(xì)胞懸浮液，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞分組及干預(yù)方式 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的NPCs，經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板，200 μl/孔，2×105個(gè)/孔，隨機(jī)分為6組。對(duì)照組(Control組)：實(shí)驗(yàn)中不加任何物質(zhì)干預(yù)；H2O2組：向培養(yǎng)基中加入H2O2[6]至終濃度為600 μmol/L；bFGF組：向培養(yǎng)基中加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)至終濃度為10 ng/ml；BBR25組：向培養(yǎng)基中加入BBR至終濃度為25 μmol/L；BBR50組：向培養(yǎng)基中加入BBR至終濃度為50 μmol/L；BBR100組：向培養(yǎng)基中加入BBR至終濃度為100 μmol/L。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)NPCs，接種于96孔板，按照分組方式進(jìn)行相應(yīng)處理后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)，分別在孵育0、24、48 h后向各組細(xì)胞中加入CCK8溶液，10 μl/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的吸光度，每組細(xì)胞共包含3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A對(duì)照組-A空白孔)。

1.4.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)NPCs，按照1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，按照分組方式進(jìn)行相應(yīng)處理后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)，每組細(xì)胞含3個(gè)復(fù)孔，孵育24 h，經(jīng)胰酶消化后收集各組細(xì)胞，PBS清洗3次，然后按照試劑盒說明書操作：用緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC 染色，并于暗處室溫孵育15 min，再加入5 μl PI染色，靜置5 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡情況。

1.4.3Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)NPCs，按照1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，按照分組方式進(jìn)行相應(yīng)處理后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)，每組細(xì)胞含3個(gè)復(fù)孔，孵育24 h后收集細(xì)胞。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Notch1、Hes1、Hes5、MMP-13、COL2A1及ACAN蛋白一抗，在4 ℃搖床中孵育24 h后再次用TBST緩沖液洗滌3次，并于相應(yīng)二抗中在室溫下孵育1 h，以β-actin為內(nèi)參蛋白。隨后，再次采用TBST緩沖液洗滌3次，滴加ECL顯影劑顯影。采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Notch1、Hes1、Hes5、MMP-13、COL2A1及ACAN蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)NPCs，按照1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，按照分組方式進(jìn)行相應(yīng)處理后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)，每組細(xì)胞含3個(gè)復(fù)孔，孵育24 h后收集細(xì)胞。采用TRIzol試劑提取總RNA，然后用兩步法RNA提取試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。選擇MMP-13、COL2A1及ACAN基因的合適上下游引物，以cDNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增待檢測(cè)基因?；虍a(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，應(yīng)用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)，以其中β-actin為內(nèi)參照。MMP-13、COL2A1及ACAN mRNA的相對(duì)含量為同一泳道目的片段積分吸光度值/內(nèi)參積分吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞孵育24 h及48 h后，H2O2組細(xì)胞增殖率低于Control組(t=6.682、3.056，P<0.05)。細(xì)胞孵育48 h后，bFGF組、BBR25組、BBR50組及BBR100組細(xì)胞增殖率高于H2O2組(t=21.251、6.792、9.181、18.417，P<0.05)。見圖1。

圖1 不同時(shí)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖情況比較

2.2 BBR對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞凋亡的影響相較于Control組，H2O2組細(xì)胞凋亡率增加(t=6.681，P<0.05)；相較于H2O2組，bFGF組、BBR25組、BBR50組及BBR100組細(xì)胞凋亡率降低(t=8.859、4.124、5.354、8.174，P<0.05)。見圖2。

2.3 BBR對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響相較于Control組，H2O2組細(xì)胞Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，而Bax及Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(t=11.390、3.525、10.613，P均<0.05)。相較于H2O2組，bFGF組、BBR25組、BBR50組及BBR100組細(xì)胞Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而Bax及Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。見圖3。

2.4 BBR對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞MMP-13、COL2A1及ACAN mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響與Control組相比，H2O2組細(xì)胞MMP-13、ACAN mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，而COL2A1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(t=10.392、6.543、14.626，P均<0.05)。與H2O2組相比，bFGF組、BBR25組、BBR50組及BBR100組細(xì)胞MMP-13、ACAN mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，而COL2A1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.05)。見圖4。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

圖3 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

2.5 BBR對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達(dá)水平的影響相較于Control組，H2O2組細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達(dá)水平均升高(t=7.645、10.036、7.746，P均<0.05)。相較于H2O2組，bFGF組、BBR25組、BBR50組及BBR100組細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達(dá)水平均降低(P均<0.05)。見圖5。

3 討論

腰椎間盤的退變始于中央的NPCs，伴隨著NPCs的減少、表型的缺失，進(jìn)而引起外層纖維環(huán)的破裂[7]。過度的細(xì)胞凋亡引起的NPCs減少是引發(fā)椎間盤退變的關(guān)鍵因素。而線粒體信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，H2O2激活的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致NPCs凋亡，從而誘導(dǎo)椎間盤退行性改變的發(fā)生。Leila et al[8]研究顯示，H2O2介導(dǎo)的線粒體膜電位下降參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NPCs凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退行性改變的發(fā)生。本研究采用H2O2處理NPCs，相較于Control組，其凋亡率得到顯著提升，認(rèn)為凋亡模型建立成功。

圖4 各組細(xì)胞MMP-13、COL2A1及ACAN mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

bFGF是一種肝素結(jié)合多肽，在椎間盤退行性病變中也起著重要的作用，能發(fā)揮分解代謝功能，而且能抑制髓核細(xì)胞凋亡。近年來隨著中醫(yī)的不斷發(fā)展，中藥治療得到廣泛應(yīng)用，療效佳且不良反應(yīng)少。BBR亦稱黃連素，具有很好的抗氧化活性，清除超氧陰離子及羥基自由基是其發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制。對(duì)于有氧化應(yīng)激途徑參與介導(dǎo)的NPCs凋亡，抗氧化干預(yù)十分重要。本研究中BBR干預(yù)可提升細(xì)胞增殖率并降低凋亡率，且隨著BBR濃度升高這一作用更為明顯，提示BBR可促進(jìn)NPCs細(xì)胞增殖并抑制其發(fā)生凋亡。Chen et al[9]研究顯示，對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的大鼠NPCs，BBR干預(yù)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并顯著抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，本研究結(jié)果與之相符。機(jī)體內(nèi)的促凋亡基因和抑凋亡基因共同參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。Bcl-2是一種癌基因，能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性，可抑制細(xì)胞凋亡；Bax基因是人體最主要的凋亡基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[10]。Caspase-3是特異的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，激活后的Caspase-3是凋亡的執(zhí)行者[11]。本研究中經(jīng)BBR干預(yù)后，大鼠NPCs Bcl-2蛋白表達(dá)量得到提升，而Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)受到抑制，提示BBR是通過提升抑凋亡蛋白表達(dá)及抑制促凋亡蛋白表達(dá)發(fā)揮對(duì)NPCs的保護(hù)作用，與bFGF療效相當(dāng)。

圖5 各組細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達(dá)水平比較

除了NPCs的過度凋亡外，NPCs中ECM降解亦是椎間盤退變的重要誘發(fā)因素[12]。髓核組織中ECM主要是由COL2A1及ACAN組成，其降解主要是由基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白酶家族參與完成，其中MMP-13對(duì)ECM降解發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。本研究結(jié)果顯示，BBR處理不僅可顯著抑制MMP-13、ACAN蛋白表達(dá)水平，而且能提升COL2A1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示BBR可通過調(diào)節(jié)COL2A1、ACAN蛋白的表達(dá)，并抑ECM制降解中間蛋白MMP-13的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)髓核細(xì)胞ECM降解的抑制作用。

Notch信號(hào)通路是一條相鄰細(xì)胞間相互作用調(diào)控的高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其被證實(shí)在骨骼發(fā)育活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，并參與調(diào)節(jié)多種骨性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程[14]。Notch信號(hào)通路由Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、Notch配體(DSL蛋白)和CSL DNA結(jié)合蛋白組成。在椎間盤退行性病變中，Notch受體蛋白的表達(dá)量增加，隨即抑制其下游靶向基因Hes1及Hes5的活性，導(dǎo)致NPCs發(fā)生凋亡及ECM降解。本研究結(jié)果顯示，H2O2可提升Notch1蛋白表達(dá)量，并抑制Hes1及Hes5蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)Notch信號(hào)通路介導(dǎo)NPCs凋亡及ECM降解過程。在予以NPCs不同濃度BBR干預(yù)后，其Notch1蛋白表達(dá)受到抑制，而Hes1及Hes5蛋白表達(dá)提升，提示BBR可通過抑制Notch信號(hào)通路抑制NPCs發(fā)生凋亡及ECM降解，發(fā)揮對(duì)NPCs的保護(hù)作用，而這一結(jié)果在劉剛 等[15]研究中也得到證實(shí)。

綜上所述，BBR可抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠NPCs凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其作用機(jī)制可能與激活Notch信號(hào)通路有關(guān)。