楊 娟，程國(guó)梅，董亞娜，張艷慧，龍文義

卵巢上皮癌(epithelial ovarian carcinoma，EOC)是最常見(jiàn)的卵巢癌組織學(xué)類型，是一種異質(zhì)性疾病[1]。目前用于治療大多數(shù)晚期卵巢癌患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)涉及細(xì)胞減滅術(shù)和鉑類化學(xué)療法，盡管許多接受初次化療的患者反應(yīng)率很高，但大多數(shù)晚期卵巢癌患者最終都會(huì)發(fā)展出對(duì)化療有抵抗力的復(fù)發(fā)性疾病[2]。因此，鑒定敏感的，非侵入性的生物標(biāo)志物以改善早期發(fā)現(xiàn)并指導(dǎo)治療尤為緊急。微小RNA(MicroRNA，miRNA在各種類型的人類癌癥中可充當(dāng)癌基因或抑癌基因[3]。miR-455-3p在多種腫瘤中低表達(dá)，作為抑癌基因參與調(diào)控各種生物進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及藥物抗性等[4-5]。已有研究[6]表明miR-455-3p通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)脂蛋白4抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而miR-455-3p在卵巢上皮癌中的作用尚不明確。該文旨在研究miR-455-3p通過(guò)靶向HDAC2對(duì)卵巢上皮性癌細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BRDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京solarbio公司；Transwell購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Ki67、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、波形蛋白(Vimentin)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，將細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，1 ∶2傳代。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組構(gòu)建HDAC2 pcDNA載體過(guò)表達(dá)HDAC2，細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：Control組、mimic組、HDAC2組、mimic+HDAC2組。

1.4RT-PCR取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HO-8910細(xì)胞，將細(xì)胞分為3組：Control組、scramble組和mimic組，Control組不做處理，scramble組轉(zhuǎn)染mimic-NC，mimic組轉(zhuǎn)染miR-455-3p mimic檢測(cè)miR-455-3p、HDAC2表達(dá)水平。用TRIzol法從HO-8910細(xì)胞中提取總RNA,用Nanodrop分光廣度計(jì)測(cè)定吸光度(A260/A280)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成和PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán); 72 ℃延長(zhǎng)10 min;存儲(chǔ)在4 ℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)HDAC2是否為miR-455-3p的直接下游靶基因，選用熒光素酶報(bào)告分析。構(gòu)建野生型和突變型HDAC2 3、UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。用PBS清洗，倒去洗滌液，加入1×ULB，在微型振蕩器中混勻5 min， 按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.6 BrdU染色將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞傳代接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，用含0.4%FBS的培養(yǎng)液同步化孵育72 h。加入終濃度為0.03 μg/ml的BrdU繼續(xù)孵育40 min。PBS洗滌細(xì)胞3次，用多聚甲醛固定10 min，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。鏡下觀察并計(jì)數(shù)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集懸浮細(xì)胞到10 ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為3×106/ml，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，用100 μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次，加入SA-FLOUS溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)，流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞分別接種于Transwell上室，下室為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后，蘇木精染色封片，測(cè)定穿過(guò)孔的細(xì)胞數(shù)目。

1.9 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移使用marker筆在細(xì)胞培養(yǎng)板做劃線處理，然后在畫(huà)線后的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)各組細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿時(shí)，利用槍頭垂直于所畫(huà)橫線進(jìn)行劃痕。劃痕后用PBS洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板，再加入無(wú)血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。于0和24 h取樣并拍照，劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.10 Western blot實(shí)驗(yàn)收集各組細(xì)胞在冰上溶解25 min。以12 000 r/min離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，在100 ℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4 ℃條件下加入相應(yīng)一抗(1 ∶1 000)并孵育過(guò)夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-455-3p與HDAC2靶向關(guān)系通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan對(duì)miR-455-3p和HDAC2的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。顯示miR-455-3p與HDAC2存在堿基結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果如圖1A所示，說(shuō)明miR-455-3p是HDAC2的靶向調(diào)節(jié)基因之一。轉(zhuǎn)染mimic后，采用RT-PCR檢測(cè)miR-455-3p、HDAC2表達(dá)水平結(jié)果如圖1B、C所示，與Control組比較，mimic組miR-455-3p表達(dá)水平升高(F=376.32，P<0.05)，HDAC2表達(dá)水平降低(F=1452，P<0.05)；為明確miR-455-3p對(duì)HDAC2的靶向關(guān)系，采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，HDAC2 wt加入miR-455-3p mimic處理后熒光素酶活性極降低(F=14.18,P<0.05，圖1D)，結(jié)果證明miR-455-3p和HDAC2存在直接靶向作用關(guān)系。

圖1 miR-455-3p與HDAC2靶向關(guān)系

2.2 miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖構(gòu)建HDAC2 pcDNA載體，RT-PCR檢測(cè)HDAC2表達(dá)水平結(jié)果如圖2A所示，與Control組比較，pcDNA-HDAC2組HDAC2表達(dá)水平升高(F=75，P<0.05)；通過(guò)BrdU染色檢測(cè)各組細(xì)胞增殖結(jié)果如圖2B、C所示，與Control組比較，mimic組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低(F=77.631，P<0.05)，HDAC2組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高(F=24.415，P<0.05)，mimic+HDAC2組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于HDAC2組(F=28.605，P<0.05)。

2.3 miR-455-3p靶向HDAC2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO-8910凋亡通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖3所示，與Control組比較，mimic組細(xì)胞凋亡率升高(F=60.736，P<0.05)，HDAC2組細(xì)胞凋亡率降低(F=0.692，P<0.05)，mimic+HDAC2組細(xì)胞凋亡率高于HDAC2組(F=12.78，P<0.05)。

2.4 miR-455-3p靶向HDAC2降低卵巢癌細(xì)胞HO-8910 Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平結(jié)果如表1所示，與Control組比較，mimic、HDAC2組Ki67(F=14.724、239.188)，PCNA(F=18.321、660.453)，c-Myc(F=56.163、377.893) mRNA水平升高(P<0.05)，mimic+HDAC2組Ki67(F=59.063)，PCNA(F=146.97)，c-Myc(F=30.253) mRNA水平低于HDAC2組(P<0.05)。

表1 miR-455-3p靶向HDAC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910 Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平的影響

圖2 miR-455-3p靶向HDAC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖的影響

圖3 miR-455-3p靶向HDAC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910凋亡的影響 與Control組比較：*P<0.05；與HDAC2組比較：#P<0.05

2.5 miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910侵襲通過(guò)Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)結(jié)果如圖4所示，與Control組比較，mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)降低(F=17.983，P<0.05)，HDAC2組侵襲細(xì)胞數(shù)升高(F=17.929，P<0.05)，mimic+HDAC2組侵襲細(xì)胞數(shù)低于HDAC2組(F=12.355，P<0.05)。

圖4 miR-455-3p靶向HDAC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910侵襲的影響 ×200

2.6 miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910遷移通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞劃痕愈合率結(jié)果如圖5所示，與Control組比較，mimic組劃痕愈合率降低(F=45.703，P<0.05)，HDAC2組劃痕愈合率升高(F=3.75，P<0.05)，mimic+HDAC2組劃痕愈合率低于HDAC2組(F=16.673，P<0.05)。

2.7 miR-455-3p靶向HDAC2下調(diào)卵巢癌細(xì)胞HO-8910 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白水平通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平結(jié)果如表2，圖6所示，與Control組比較，mimic組VEGF(F=12.165)，Vimentin(F=28.604)，F(xiàn)ibronectin(F=53.539)蛋白水平降低(P<0.05)；HDAC2組VEGF(F=27.263)，Vimentin(F=181.62)，F(xiàn)ibronectin(F=134.537)蛋白水平升高(P<0.05)；mimic+HDAC2組VEGF(F=29.967)，Vimentin(F=206.929)，F(xiàn)ibronectin(F=100.366)蛋白水平低于HDAC2組(P<0.05)。

表2 miR-455-3p靶向HDAC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

上皮性卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。上皮性卵巢癌通常在晚期被診斷為廣泛擴(kuò)散的腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移，其5年生存率通常低于30%[7]。探索卵巢上皮癌的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，確定侵襲和轉(zhuǎn)移的主要因素，對(duì)卵巢上皮癌治療和預(yù)后具有重要意義。HDAC-2是HDACs家族的成員，能促進(jìn)激素和依賴細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 并且能維持代謝平細(xì)胞周期和腫瘤形成的平衡和調(diào)節(jié)，在上皮性卵巢癌的形成中起重要作用[8]。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，顯示miR-455-3p和HDAC2存在直接靶向作用關(guān)系。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-455-3p靶向HDAC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910遷移的影響 ×200a：Control組；b：mimic組；c：HDAC2組；d：mimic+HDAC2組;與Control組比較：*P<0.05；與HDAC2組比較：#P<0.05

圖6 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平

凋亡是人類癌癥中一個(gè)重要的病理變化，誘導(dǎo)上皮性卵巢癌凋亡是治療上皮性卵巢癌的一個(gè)重要方式。Zheng et al[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-455-3p通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在HCT116細(xì)胞中起抗癌基因的作用。Chai et al[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-455-3p過(guò)表達(dá)抑制了A375細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，阻止了細(xì)胞周期，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，可作為黑色素瘤的潛在靶向治療選擇。本研究表明miR-455-3p通過(guò)靶向HDAC2具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO-8910凋亡的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞HO-8910凋亡。

細(xì)胞增殖在卵巢癌的臨床行為和侵襲性中起重要作用。Ki67抗原的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、血管的侵襲、腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后的保留和對(duì)化學(xué)療法的不良反應(yīng)有關(guān)。PCNA是一種細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，可作為上皮性卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)。c-Myc屬于myc原癌基因家族，是一種核蛋白型基因，有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，導(dǎo)致腫瘤形成，高表達(dá)時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞增殖并誘發(fā)凋亡，在大部分惡性腫瘤中有的基因擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)。miR-455-3p通過(guò)靶向HDAC2具有抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖，降低Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖。

侵襲和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是惡性腫瘤的最重要的生物學(xué)特征，并且是癌癥治療中的最大挑戰(zhàn)。卵巢癌可通過(guò)直接侵襲到鄰近器官或通過(guò)腹水經(jīng)結(jié)腸轉(zhuǎn)移而擴(kuò)散[11]。Li et al[12]研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-455-3p通過(guò)靶向腫瘤抑制物EI24促進(jìn)三陰性乳腺癌的侵襲和遷移。劉益娟 等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-455-3p mimics可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路抑制HCT116細(xì)胞的遷移及侵襲。miR-455-3p通過(guò)靶向HDAC2具有抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910侵襲和遷移的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910侵襲和遷移。

在卵巢腫瘤形成過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷血管生成轉(zhuǎn)換，在那里它們?cè)黾哟傺苌梢蜃拥谋磉_(dá)，以促進(jìn)新血管系統(tǒng)的形成以支持腫瘤生長(zhǎng)。血管生成的程度與疾病進(jìn)展和EOC的生存期有關(guān)[14]。VEGF是最重要的血管生成開(kāi)關(guān)分子之一，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的行為，包括遷移、增殖和分化起著重要的作用[15]。纖維粘連蛋白是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的一種非膠原糖蛋白，與波形蛋白在上皮性腫瘤中表達(dá)增加，與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和不良預(yù)后有關(guān)，被認(rèn)為是癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的必要條件。miR-455-3p通過(guò)靶向HDAC2具有降低卵巢癌細(xì)胞HO-8910 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2降低卵巢癌細(xì)胞HO-8910運(yùn)動(dòng)能力。

綜上所述，miR-455-3p靶向HDAC2具有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞HO-8910凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，降低運(yùn)動(dòng)能力的作用。說(shuō)明以miR-455-3p為分子靶向治療可作為上皮性卵巢癌的潛在生物治療靶點(diǎn)。