李欽艷，鐘瑩瑩，李 忠，肖自添，古培總，何煥清，鐘小云，彭洋洋

（1梅州市農(nóng)林科學院微生物研究所，廣東 梅州 514071；2廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所/廣東省草菇科技創(chuàng)新中心/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

靈芝(Ganoderma lingzhi)為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬食藥用菌，是中國傳統(tǒng)的中藥材[1]，并于2019年11月25日被國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局認定為醫(yī)食同源物質(zhì)，深受消費者喜愛。靈芝化學成分復雜，含有多種活性物質(zhì)，如多糖、三萜類、甾醇、腺苷、氨基酸、脂肪類等[2]。其中，多糖和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，是孢子粉和靈芝子實體的重要生物活性物質(zhì)，其含量可作為衡量靈芝質(zhì)量的標準[3]，多糖的生物活性適用于提高免疫力、抗腫瘤和抗衰老[4]，三萜類的生物活性適用于抗炎、保肝護肝[5-6]。蛋白質(zhì)是靈芝除靈芝多糖和三萜外的又一重要活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]等作用[10]，靈芝中的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(fungai immunomodulatory protein，F(xiàn)IP)Ling Zhi-8有促進淋巴細胞增殖、抗炎、抗過敏、抗排斥、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等作用[11]。靈芝中有近20種甾醇類，其骨架分為麥角甾醇類和膽甾醇類2種類型，靈芝膽甾醇類化合物有神經(jīng)保護作用[11]。腺苷也是靈芝主要活性成分之一，屬于核苷類化合物，具有抑制體內(nèi)血小板聚集，提高血紅蛋白含量，加速血液循環(huán)，有效降低血液粘稠度，對心血管系統(tǒng)有廣泛的調(diào)節(jié)作用[12]。靈芝的脂肪類物質(zhì)同樣具有重要的生理功能，主要物質(zhì)脂肪酸能提供能量、參與細胞膜組織結(jié)構(gòu)等，還具有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒等功效，特別是不飽和脂肪酸，在抗腫瘤、降低心腦血管疾病、延緩免疫功能衰退等方面有重要作用[13-14]。靈芝子實體生長經(jīng)歷菌蕾期、菌柄分化期、子實體分化期、子實體成熟期、孢子成熟期、孢子收獲后期等階段，其活性成分含量會因不同生長階段、栽培環(huán)境、品種、栽培配方、培養(yǎng)方式、采收時間等而變化[6,14-18]。研究不同生長發(fā)育階段靈芝子實體與孢子粉活性成分含量的相關(guān)性，探索靈芝及孢子粉的最佳采收時期，對實際生產(chǎn)和消費指導具有十分重要的意義。

前人的研究大多集中在不同生長階段靈芝子實體多糖、三萜類化合物的含量、組成等變化，或者單純比較靈芝子實體與孢子粉的差異等，未見根據(jù)實際生產(chǎn)情況，對靈芝子實體與孢子粉采收時間進行綜合分析，未見報道不同收集時期孢子粉的活性成分含量分析。

本研究以梅州本地主栽品種‘梅靈1號’靈芝為研究材料，結(jié)合當?shù)卦耘嗔晳T和栽培方法對不同階段靈芝子實體和孢子粉活性成分進行研究。旨在通過分析靈芝不同生長階段子實體及不同收粉時期孢子粉的活性成分，為靈芝子實體和孢子粉最佳采收期的確定提供理論依據(jù)，也為消費者選擇相關(guān)靈芝產(chǎn)品提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

‘梅靈1號’（梅州本地品種）靈芝菌株來源于梅州市農(nóng)林科學院微生物研究所菌種保藏中心。試驗于2019年6—10月在梅州市農(nóng)林科學院微生物研究所靈芝示范基地進行，靈芝子實體和孢子粉由該基地栽培采收獲得。孢子粉經(jīng)專用破壁機低溫破壁處理。

1.2 試驗材料

雜木屑、干玉米粒、馬鈴薯、麩皮、玉米粉、石灰、石膏等均購自當?shù)亟?jīng)銷商。栽培原料符合《食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求(NY 5099—2002)》，不使用任何添加劑和殺菌、殺蟲劑等。

1.3 試驗配方

1.3.1 母種配方 馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，pH自然。

1.3.2 原種培養(yǎng)基配方 干玉米粒（不粉碎）99%、石膏1%，含水量約60%，pH 8。

1.3.3 栽培種及栽培菌包配方 雜木屑78%、玉米粉6%、麩皮15%、石膏粉1%，含水量約60%，pH 8。

1.4 栽培方法

1.4.1 子實體培養(yǎng) 采用常規(guī)靈芝室內(nèi)代料栽培方法，具體操作參照文獻[19]。原材料混勻后調(diào)整含水量至60%，試驗選用規(guī)格為17 cm×35 cm、厚5 mm的聚丙烯塑料袋，每袋裝培養(yǎng)料（干重計）350 g，裝好后用常壓滅菌方式滅菌，保持100℃下恒溫16～18 h。滅菌后冷卻至室溫接種，接種時嚴格按無菌操作規(guī)程進行。接種后將菌包搬入培養(yǎng)室進行墻式排放，自然溫度條件下培養(yǎng)發(fā)菌，室內(nèi)保持黑暗，早上、中午、晚上各通風1 h，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)受污染的菌包及時清理出培養(yǎng)室，菌絲滿菌袋時間約為45天。待菌絲長滿菌包進行出芝管理。用小刀在菌袋的扎口上方開一個十字形的小口，靈芝子實體將由十字形小口長出。開好口后將菌袋均勻擺放到出菇房，溫度22～28℃，空氣相對濕度85%～95%，出菇房經(jīng)常通風換氣，保持新鮮的氧氣供應。

1.4.2 孢子粉收集 試驗菌袋上長出的靈芝子實體邊沿的金黃色轉(zhuǎn)為棕紅色時，將菌包清洗干凈，選擇長勢相當?shù)撵`芝同時上架（靈芝孢子粉收集培養(yǎng)架采用杉木制作，多層式培養(yǎng)架規(guī)格為長×寬×高=2 m×1 m×2 m，分3層，層間距為60 cm）。上架完畢后用白紙進行密封，采用常規(guī)方法進行產(chǎn)粉管理，溫度22～28℃，空氣相對濕度85%～95%，經(jīng)常通風換氣，保持新鮮的氧氣供應。

1.5 樣品采集

1.5.1 靈芝子實體采集 共采集4個不同生長階段的靈芝子實體。（1）菌蕾期子實體，剛剛長出菌袋切口的幼嫩靈芝（圖1a）；（2）成熟期子實體，子實體邊沿的金黃色轉(zhuǎn)為棕紅色時，剛剛成熟但未彈粉的子實體（圖1b）；（3）彈粉期子實體，上架20天收集孢子粉（頭道孢子粉）后的子實體（圖1c）；（4）彈粉后期子實體，上架40天，即頭道孢子粉收集后重新上架培養(yǎng)20天，再收集孢子粉（二道孢子粉）后的子實體（圖1c）。

1.5.2 靈芝孢子粉采集 按照梅州本地的常規(guī)靈芝孢子粉收粉方法，有一次收集法和二次收集法2種。一次收集法是把靈芝放入收集架里，持續(xù)等到孢子粉彈射完畢后一次性收集孢子粉。二次收集法是孢子粉彈射一定時間收集孢子粉后，將靈芝重新放回收集架，再培養(yǎng)，再收集。本試驗設計的上架彈粉階段共計40天，共采集3種靈芝孢子粉樣品。（1）上架彈粉20天即開架收集孢子粉，此階段收集的孢子粉稱為頭道孢子粉；（2）頭道孢子粉收集后重新上架密封，繼續(xù)彈粉20天，開架收集孢子粉，此階段收集的孢子粉稱為二道孢子粉；（3）產(chǎn)孢40天孢子粉，收集上架密封后持續(xù)彈粉40天的孢子粉。所有靈芝孢子粉樣品都經(jīng)相同條件破壁后再進行營養(yǎng)成分檢測。

圖1 靈芝子實體

1.6 營養(yǎng)成分檢測

成分分析委托中國廣州分析測試中心完成。靈芝多糖、三萜及甾醇類化合物測定方法參照《中國藥典（2015年版一部）》靈芝項下；腺苷測定方法參照NY/T 2116—2012；蛋白質(zhì)測定方法參照GB 5009.5—2016第一法；脂肪測定方法參照GB 5009.6—2016第一法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品多糖含量比較

從圖2可以看出，不同生長階段靈芝子實體的多糖含量呈下降趨勢，菌蕾期含量最高，為0.65%，成熟期子實體多糖下降為0.43%，彈粉后子實體多糖含量趨于穩(wěn)定，但顯著低于菌蕾期和成熟期，分別為0.28%、0.27%。孢子粉二次收集法比一次收集法多糖含量高，其中二道孢子粉多糖含量最高，達0.85%，其次是頭道孢子粉，分別比40天一次性收集的孢子粉多糖含量提高21.43%和18.57%，表明采用二次收集法的孢子粉多糖含量更高，但頭道孢子粉與二道孢子粉多糖含量沒有顯著差異。此外，孢子粉多糖含量高于子實體，其中二道孢子粉多糖含量比彈粉后期上架40天子實體高2倍以上。

圖2 不同樣品多糖含量比較

圖3 不同樣品三萜及甾醇含量比較

2.2 不同樣品三萜及甾醇含量比較

從圖3可以看出，靈芝子實體的三萜及甾醇含量比較穩(wěn)定，不同階段間沒有顯著差異，菌蕾期含量為2.2 g/100 g，其余時期含量均為1.9 g/100 g。不同階段的破壁孢子粉三萜及甾醇含量差別也不大，為12～14 g/100 g，上架收集40天的破壁孢子粉含量最高，達14 g/100 g，其次為二道孢子粉，一次收集法三萜及甾醇含量高于二次收集法。孢子粉三萜及甾醇含量遠高于靈芝子實體，約為靈芝子實體的6～12倍。

2.3 不同樣品腺苷含量比較

從圖4可以看出，不同生長階段靈芝子實體的腺苷含量差異很大，菌蕾期和成熟期的子實體腺苷含量低于檢測下限（檢測下限為10 mg/kg），彈粉后開始增加，彈粉期為86.5 mg/kg，彈粉后期為99.2 mg/kg。破壁孢子粉腺苷含量顯著高于子實體，其中二道孢子粉的腺苷含量最高(214 mg/kg)，二次法收集的孢子粉腺苷含量高于一次法收集的。

2.4 不同樣品蛋白質(zhì)含量比較

從圖5可知，不同生長階段靈芝子實體的蛋白質(zhì)含量差異較大，隨著子實體的生長呈下降趨勢。幼嫩、未成熟的子實體蛋白質(zhì)含量高，彈射孢子粉后含量下降明顯。菌蕾期蛋白質(zhì)含量最高(25.5 g/100 g)，彈粉后期降到最低(8.14 g/100 g)，彈粉后子實體蛋白質(zhì)含量沒有顯著差異，趨于穩(wěn)定。不同采收期的孢子粉蛋白質(zhì)含量比較穩(wěn)定，分別為16.3、16.1、16.6 g/100 g，沒有顯著差異，孢子粉蛋白質(zhì)含量高于成熟期的子實體含量。

圖4 不同樣品腺苷含量比較

2.5 脂肪含量分析

從圖6可知，不同生長階段靈芝子實體的脂肪含量較低，且差異不大。不同采收期的破壁孢子粉脂肪含量高且較穩(wěn)定，不同采收期沒有顯著差異，頭道孢子粉含量最高(34.2 g/100 g)，二次收集法脂肪含量高于一次收集法。孢子粉脂肪含量極顯著高于子實體含量，約為子實體的9～13倍。

3 結(jié)論

菌蕾期子實體活性成分含量高，多糖、三萜及甾醇、蛋白質(zhì)、脂肪含量分別為0.65%、2.2 g/100 g、25 g/100 g、3.1 g/100 g，高于其他時期子實體活性成分含量，生產(chǎn)中多余的菌蕾往往被修剪下來，這些菌蕾可以食用或者作為活性成分提取原材料。

子實體多糖、蛋白質(zhì)含量隨著子實體生長而逐漸降低，三萜及甾醇、脂肪含量比較穩(wěn)定，沒有顯著變化，腺苷隨著子實體生長而增加，在未成熟的靈芝子實體中未檢出。若不收集孢子粉，靈芝采收時間可適當提前至成熟期（孢子粉未彈射），即子實體剛剛成熟時，此時各種活性成分含量較高。

不同階段破壁孢子粉的多糖、三萜及甾醇、腺苷、脂肪含量均高于靈芝子實體，其中三萜及甾醇含量約為子實體的6～12倍，脂肪為9～13倍。

頭道孢子粉、二道孢子粉、上架收集40天孢子粉的多糖、三萜及甾醇、腺苷、脂肪、蛋白質(zhì)等活性成分無明顯差異，粉碎了靈芝孢子粉市場上關(guān)于頭道孢子粉營養(yǎng)價值更高的謠傳。

4 討論

圖5 不同樣品蛋白質(zhì)含量比較

靈芝子實體不同生長階段活性成分的含量和變化一直是人們關(guān)注的問題，其受生長階段、栽培環(huán)境、品種、栽培配方、培養(yǎng)方式、采收時間等因素影響而變化[6,14-18]，目前并沒有統(tǒng)一的規(guī)律或者標準來評價靈芝產(chǎn)品質(zhì)量。筆者首次比較完整地研究了靈芝子實體不同生長階段以及孢子粉不同收粉階段主要活性成分的含量和變化規(guī)律。試驗結(jié)果表明：（1）子實體多糖含量隨著子實體生長而降低，菌蕾期最高，彈粉后趨于穩(wěn)定，此結(jié)果與李保明[20]、林應興[21]等研究結(jié)果相似，推測子實體成熟后大部分多糖轉(zhuǎn)移到孢子粉中。試驗結(jié)果也顯示，孢子粉多糖含量明顯高于子實體。陳軍輝[22]、于華崢[23]等對靈芝子實體、菌絲體及孢子粉中多糖成分差異比較研究也表明，靈芝孢子粉多糖含量高于子實體，與本研究結(jié)果一致。（2）子實體不同生長階段三萜含量比較穩(wěn)定，各生長階段間差異不大，菌蕾期最高。而徐新然等[24]指出，靈芝木段栽培法的總?cè)扑岷吭陟`芝現(xiàn)蕾期、菌蓋形成期變化不明顯，彈孢子粉前期最高（與現(xiàn)蕾期、菌蓋形成期差異不顯著），在彈孢子粉后期顯著降低，此結(jié)果與本試驗有一定差異，推測與靈芝品種、栽培方法、栽培環(huán)境等因素有關(guān)。本試驗中孢子粉的三萜與甾醇含量極顯著高于子實體。譚洪升等[25]采用高氯酸顯色法測定靈芝子實體和破壁靈芝孢子粉中的三萜含量，證實破壁靈芝孢子粉中的三萜質(zhì)量分數(shù)明顯高于靈芝子實體，與本研究結(jié)果一致；于華崢等[26]通過高效液相色譜檢測靈芝菌絲體、子實體、孢子粉（未破壁）的三萜含量，顯示子實體的三萜種類多樣且含量高，菌絲體中三萜主要為靈芝酸S且含量低，未破壁孢子粉中基本檢測不到靈芝三萜，說明孢子粉破壁是三萜類物質(zhì)釋放的關(guān)鍵要素。（3）腺苷含量隨著子實體生長而增加，在未成熟的靈芝子實體中未檢出，孢子粉的腺苷含量顯著高于子實體。于華崢等[26]研究了靈芝菌絲體、子實體、孢子粉（未破壁）的三萜含量，結(jié)果顯示只在孢子粉中檢測到靈芝腺苷。（4）蛋白質(zhì)含量隨著子實生長呈下降趨勢，菌蕾期最高，孢子粉含量顯著高于子實體，于華崢等[26]研究結(jié)果也顯示，孢子粉蛋白質(zhì)含量最高，其次是子實體，菌絲體含量最低。（5）子實體脂肪含量較低，孢子粉的脂肪含量高，為子實體的10倍以上，占靈芝脂肪總量的90%左右，子實體間不同階段、孢子粉間不同階段均無顯著差異。孟楠楠等[27]對6個靈芝子實體及破壁孢子粉粗脂肪等營養(yǎng)成分進行比較，結(jié)果顯示破壁孢子粉粗脂肪含量約為子實體粗脂肪含量的10倍，子實體間不同處理、孢子粉間不同處理均無顯著差異，與本試驗結(jié)果一致。

圖6 不同樣品脂肪含量比較

菌蕾期多糖、三萜類、蛋白質(zhì)、脂肪等活性成分含量較高，生產(chǎn)中修剪下來的菌蕾可以進一步加工利用。課題組將進一步對不同生長階段靈芝子實體、孢子粉的活性成分進行深入研究。本試驗的初步結(jié)論為開發(fā)靈芝產(chǎn)品提供了更有針對性、更有效、更合理的參考，對實際生產(chǎn)和理性消費具有一定的指導作用。