袁 哲，尹燕杰 ,馬宏宇

(哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，哈爾濱150525)

肝素鈉系自豬腸黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，是由不同分子質(zhì)量的糖鏈組成的混合物.肝素鈉注射液為肝素鈉的滅菌水溶液，輔料包括注射用水、氯化鈉，個(gè)別生產(chǎn)廠家會(huì)在生產(chǎn)過程中加入一定量的苯酚.苯酚是注射劑中常用的抑菌劑，同時(shí)也是世界公認(rèn)的致癌物質(zhì).一方面，苯酚含量過低無法保證制劑質(zhì)量;另一方面含量過高又會(huì)對人體產(chǎn)生危害.肝素鈉注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版二部[1]，但其標(biāo)準(zhǔn)中并未對可能添加的苯酚成分進(jìn)行檢測.本文通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-12]建立了HPLC法測定肝素鈉注射液中含苯酚的量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù).

1 儀器與試藥

Waters 2695-2998高效液相色譜儀；Mettler電子天平XS105.苯酚對照品(批號(hào)100509-201804，體積分?jǐn)?shù)為100%)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)，實(shí)驗(yàn)用水為Milili-Q純水機(jī)制備.肝素鈉注射液(A廠家生產(chǎn)，規(guī)格2 mL，批號(hào)：1607319)、肝素鈉注射液(B廠家生產(chǎn)，規(guī)格2 mL，批號(hào)：51709106)、肝素鈉注射液(C廠家生產(chǎn)，規(guī)格2 mL，批號(hào)：1703103)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL.

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液

對照溶液(1) 精密稱取苯酚對照品26.59 mg置5 mL量瓶中,加水溶解定容至刻度，搖勻，即得.

對照溶液(2) 精密稱取苯酚對照品74.92 mg置25 mL量瓶中,加水溶解定容至刻度，搖勻，即得.

對照溶液(3) 精密稱取苯酚約10 mg置100 mL量瓶中,加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得.

2.2.2 供試品溶液

精密吸取供試品1.0 mL置25 mL量瓶中,加水稀釋至刻度，搖勻，即得.

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

精密吸取對照溶液(1)100 μL置10 mL量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻.吸取10 μL進(jìn)樣，在該色譜條件下，苯酚的保留時(shí)間約為6.1 min,理論塔板數(shù)大于10 000，拖尾因子為1.10，峰面積RSD為0.10%(n=7)；在被測的三個(gè)廠家的樣品色譜圖中，苯酚與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，其他組分峰均不干擾苯酚的測定，專屬性較好，典型色譜圖見圖1 .

圖1 專屬性HPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取對照溶液(1)50、100、200、400、600、800 μL分別置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度.再分別吸取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖.以苯酚的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，求得回歸方程為：

Y=1.0×107X-1.314×104r=1

結(jié)果表明，苯酚在26.59～425.44 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系.

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取苯酚對照溶液(3)，連續(xù)進(jìn)樣6次,主峰面積的RSD=0.87%,保留時(shí)間的RSD=0.12%，表明儀器的精密度良好.

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品(1703103)照上述“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)峰面積法計(jì)算含苯酚量.結(jié)果苯酚的平均質(zhì)量濃度為2.47 mg·mL-1，RSD=0.36%，表明此方法的重復(fù)性良好.

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液(1703103)放置于室溫，分別在0、2、4、6、8、12 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)，按上述“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣并計(jì)算含苯酚的量，結(jié)果平均質(zhì)量濃度為2.46 mg·mL-1,RSD=0.20%,表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.4.5 回收率試驗(yàn)

分別精密吸取苯酚對照溶液(2)0.8、1.0、1.2 mL,各3份，分別置于25 mL量瓶中，再依次加入已知不含苯酚的肝素鈉注射液1.0 mL，加水稀釋并定容至刻度，設(shè)為低、中、高三個(gè)組，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別計(jì)算每組的回收率(n=9).結(jié)果樣品的平均回收率為99.23%，RSD為0.51%.結(jié)果見表1.

表1 回收率(n=9)

2.5 樣品測定

按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取對照溶液(3)及供試品溶液分別進(jìn)樣，按外標(biāo)峰面積法,計(jì)算苯酚的標(biāo)示百分含量，結(jié)果見表2.

表2 肝素鈉注射液中含苯酚的量

3 討 論

《中國藥典》2015年版四部注射劑通則中規(guī)定，靜脈給藥注射液不得添加抑菌劑[13].但由于一些制劑的不穩(wěn)定性，在其生產(chǎn)中可能會(huì)加入一定量的抑菌劑.抑菌劑在保證人體安全性的前提下，對制劑在貯存、應(yīng)用過程中的制劑質(zhì)量起到很大的作用.目前苯酚的測定方法很多，原料藥采用的是溴量法，還有采用紫外法、氣相色譜法等[2].本文建立了高效液相色譜法，以甲醇-水(60∶40)為流動(dòng)相，測定肝素鈉注射液中含苯酚的量.通過對市售三個(gè)廠家的樣品測定發(fā)現(xiàn)，藥品說明書中未標(biāo)注添加了苯酚的品種，經(jīng)檢測均未檢出苯酚.其中一個(gè)廠家標(biāo)注了每100 mL中含苯酚0.25 g，經(jīng)檢測其含量為標(biāo)示量的98.4%.經(jīng)方法學(xué)考察，本方法簡便、準(zhǔn)確，可用于肝素鈉注射液中苯酚的測定.