楊馨，王琳源，張文娟，張秀梅，高秀秋，關(guān)寧

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科；3.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室；4.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000)

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一種由牙菌斑微生物引發(fā)的破壞牙周支持組織(包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì))的慢性炎癥性疾病[1]。因其發(fā)病早期臨床癥狀不顯著容易被患者忽視，就診時(shí)往往發(fā)展成為重度慢性牙周炎，出現(xiàn)牙齒松動(dòng)或脫落。慢性牙周炎不僅是導(dǎo)致我國成人牙齒缺失的主要原因，而且與系統(tǒng)性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等關(guān)系密切，影響人們的全身健康[2]。造成慢性牙周炎的病因有微生物因素、宿主易感性以及環(huán)境因素等，慢性牙周炎病因的復(fù)雜性決定了疾病治療的復(fù)雜性。雖然在臨床上采用機(jī)械性清除菌斑、牙周組織再生手術(shù)以及一些輔助治療措施在一定程度上控制和改善了病損區(qū)的牙周狀況[3-4]，但對(duì)于重度慢性牙周炎，如何有效控制炎癥進(jìn)展，促進(jìn)牙周組織修復(fù)仍是當(dāng)前牙周研究的重點(diǎn)。近來越來越多研究證明慢性牙周炎是由宿主的免疫系統(tǒng)和牙菌斑中的微生物相互作用而產(chǎn)生的炎癥性疾病，宿主對(duì)抗牙周致病菌的免疫應(yīng)答影響著慢性牙周炎的炎癥進(jìn)展和組織損傷[5]。Treg細(xì)胞是一類具有調(diào)節(jié)功能的CD4+T亞群，在維持體內(nèi)免疫耐受及調(diào)控抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。有關(guān)在重度慢性牙周炎中Treg介導(dǎo)的免疫應(yīng)答情況尚未有相關(guān)報(bào)道。為此，在本研究中我們通過檢測重度慢性牙周炎患者病損組織中Treg細(xì)胞相關(guān)因子Foxp3和IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)，研究Treg細(xì)胞在重度慢性牙周炎中的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Marker(賽默飛公司，美國)；Foxp3抗體(Cell Signaling公司，美國)；IL-10抗體(Cell Signaling公司，美國)；β-actin(Bioss公司，中國)；羊抗兔二抗(EarthOx LLC公司，美國)；BCA蛋白測定試劑盒(鼎國昌盛公司，中國)；PVDF膜(GE公司，美國)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天公司，中國)；HiScript II One Step RT-PCR Kit(Vazyme公司，中國)；100 bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司，中國)；Trizol(ambion，中國)；Foxp3引物合成(鼎國昌盛公司，中國)；IL-10引物合成(鼎國昌盛公司，中國)；DEPC水(鼎國昌盛公司，中國)。

1.2 樣本采集和處理

收集2018年1月至6月期間，于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科就診并診斷為重度牙周炎，且無保留意義需要拔除的患牙15例，取患牙的牙齦組織作為實(shí)驗(yàn)組。同期收集15例因埋伏阻生需要拔除的第三磨牙，取冠方覆蓋的健康牙齦組織作為對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)探診深度>6 mm；(2)附著喪失≥5 mm；(3)牙槽骨吸收超過根長的1/2；(4)炎癥較明顯，可伴有牙周膿腫；(5)后牙有Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病變。診斷為重度牙周炎的患者需要2顆及以上患牙具有上述前3項(xiàng)特征；如僅有2顆患牙，這2顆患牙須不相鄰，且至少位于不同象限。

健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)探診深度<3 mm；(2)無附著喪失；(3)無牙槽骨吸收；(4)牙齦無炎癥，探針不出血。

患者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近6個(gè)月內(nèi)接受過牙周治療；(2)近6個(gè)月內(nèi)服用抗生素，非甾體類抗炎藥和免疫抑制類藥物；(3)患有系統(tǒng)性疾病；(4)妊娠、哺乳期和正在服用避孕藥的女性；(5)吸煙。

1.3 RT-PCR檢測

1.3.1 RNA提取

Trizol法提取牙齦組織的RNA。紫外分光光度計(jì)測量RNA濃度及OD 值，樣本260/280 nm OD比值均在1.8～2.2，記錄總RNA 濃度，單位ng/μL。操作完成后，凍存于-80 ℃冰箱或直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.2 RT-PCR 反應(yīng)

按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，中國)配置25 μL反應(yīng)體系，加入反應(yīng)體系中RNA的量約為300 ng。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物設(shè)計(jì)：

Foxp3引物序列：

上游引物序列:5′-CAAGTGGCCCGGATGTGAGA-3′，下游引物序列5′- TGAGCGTGGCGTAGGTGAAAG-3′。擴(kuò)增目的基因片段長度為440 bp。

IL-10引物序列：

上游引物序：5′-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3′，下游引物序列：5′- TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3′。擴(kuò)增目的基因片段長度為112 bp。

以β-actin 為內(nèi)參照物：

上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT -3′，下游引物序列5′- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。擴(kuò)增目的基因片段長度為285 bp。

引物均由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為94 ℃，5 min；35個(gè)PCR循環(huán)(94 ℃，30 s；72 ℃，1 min)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠分離，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)掃描后測量譜帶強(qiáng)度。

1.4 western-blot檢測

取出適量標(biāo)本，室溫融化，加入150 μL裂解液，反復(fù)吹打以充分裂解細(xì)胞，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)蛋白定量后按20微克/孔行10%聚丙烯酰胺(10%SDS-PAGE)電泳并經(jīng)濕式轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉后，取一抗稀釋液(TBST液)按照1∶1000稀釋Foxp3，IL-10抗體，4 ℃搖床過夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀釋的二抗，室溫振搖孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法顯色、曝光后測量X光膠片上條帶密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR結(jié)果

我們采用RT-PCR法檢測兩組牙齦組織中Treg細(xì)胞相關(guān)因子Foxp3和IL-10的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：Foxp3和IL-10的mRNA在健康牙齦組織和重度慢性牙周炎的病變牙齦組織中均有表達(dá)，并且重度慢性牙周炎組Foxp3和IL-10mRNA的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異顯著(P<0.01)，見表1、圖1、圖2。

表1 兩組中Foxp3、IL-10的mRNA表達(dá)及比較

N：健康對(duì)照組；P：重度慢性牙周炎組

圖2 牙齦組織中Foxp3、IL-10mRNA表達(dá)**P<0.01

2.2 western-blot 檢測結(jié)果

進(jìn)一步，我們通過western-blot檢測牙齦組織中Foxp3和IL-10的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：健康的牙齦組織有Treg細(xì)胞相關(guān)因子Foxp3和IL-10蛋白的表達(dá)。與健康對(duì)照組相比，重度慢性牙周炎組中Foxp3和IL-10的蛋白表達(dá)水平增高，差異顯著(P<0.05)，見表2、圖3、圖4。

表2 兩組中Foxp3、IL-10的蛋白表達(dá)及比較

N：健康對(duì)照組；P：重度慢性牙周炎組

圖4 兩組中Foxp3、IL-10的蛋白表達(dá)**P<0.01和*P<0.05

3 討 論

慢性牙周炎是最為常見的一類牙周疾病。根據(jù)牙周袋深度、結(jié)締組織附著喪失和骨吸收的程度分為輕度、中度和重度[9]。1990—2017年全球口腔疾病流行趨勢的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)全球未經(jīng)治療的重度牙周炎發(fā)生率為79.0%，中國是重度牙周炎標(biāo)準(zhǔn)化治療需求最高的國家之一[10]。慢性牙周炎發(fā)病的關(guān)鍵因素是牙周病原體形成的生物膜引發(fā)并導(dǎo)致牙周組織局部出現(xiàn)大量炎癥介質(zhì)為特征的免疫炎癥反應(yīng)，造成牙周病原體和宿主之間相互作用的失衡狀態(tài)[11]。以往研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者牙齦組織與外周血中Treg細(xì)胞比例高于健康人群。提示Treg細(xì)胞在宿主體內(nèi)的增殖與慢性牙周炎密切相關(guān)[12-13]。

Treg細(xì)胞可分為胸腺來源的自然Treg細(xì)胞(natual Treg，nTreg)和外周來源的誘導(dǎo)Treg細(xì)胞(induced Treg，iTreg)，部分CD4+胸腺細(xì)胞進(jìn)行分化時(shí)，抗原呈遞細(xì)胞所呈遞的一些特異性抗原可誘導(dǎo)Foxp3分子產(chǎn)生，這類CD4+胸腺細(xì)胞分化產(chǎn)生的nTreg細(xì)胞表面可穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)Foxp3分子；外周幼稚T細(xì)胞受轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β的持續(xù)性刺激可分化為iTreg細(xì)胞，iTreg細(xì)胞表面Fopx3分子也可穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)[14]。在免疫穩(wěn)態(tài)下，各器官中Treg細(xì)胞數(shù)量基本恒定，調(diào)控自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化與增殖，在確保自身免疫耐受的同時(shí)啟動(dòng)有效的免疫防御機(jī)制；在炎癥反應(yīng)中，T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)介導(dǎo)的信號(hào)刺激引起Treg細(xì)胞增殖，發(fā)揮非抗原特異性免疫抑制作用，進(jìn)而調(diào)控炎癥程度[15]。研究發(fā)現(xiàn)，人X染色體連鎖的先天免疫缺陷綜合征(immunodysregulation，polyendocrinopathy，and enteropathy，X-linked syndrome，IPEX)與Foxp3蛋白編碼基因突變有關(guān)，此外Foxp3蛋白及mRNA的表達(dá)情況還與銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病密切相關(guān)，提示Foxp3在Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[16]。在本研究中，重度慢性牙周炎患者牙齦組織Foxp3表達(dá)高于健康人群，提示Treg細(xì)胞在慢性牙周炎的病損牙周組織中功能增強(qiáng)，參與炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)控。

Treg細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，其中IL-10是慢性牙周炎發(fā)病過程中的重要調(diào)節(jié)因子[17]。IL-10是參與感染調(diào)節(jié)過程的基本細(xì)胞因子，具有多效性，可來源于Treg細(xì)胞，調(diào)控Treg細(xì)胞的增殖，協(xié)助Treg細(xì)胞在慢性炎癥的初始階段抑制中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞激活并促進(jìn)其凋亡，減少炎性細(xì)胞外滲，并可直接抑制輔助T細(xì)胞的作用，防止機(jī)體炎癥過度活化及出現(xiàn)自身免疫癥狀[18-19]。Jiayin[20]等人通過對(duì)比慢性牙周炎患者與健康者牙齦組織中IL-10的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者牙齦組織中IL-10表達(dá)增高，這提示IL-10在慢性牙周炎進(jìn)展中可能起重要作用。程培紅[21]等人在對(duì)慢性牙周炎患者進(jìn)行基礎(chǔ)牙周治療后，菌斑微生物對(duì)牙周刺激減弱，IL-10表達(dá)水平持續(xù)升高，提示IL-10可能通過抑制促炎因子和趨化因子等炎性成分，為后續(xù)炎癥修復(fù)和組織再生奠定良好基礎(chǔ)，并在修復(fù)過程中起一定作用。與上述報(bào)道相一致，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞相關(guān)因子IL-10在重度慢性牙周炎牙齦組織中的表達(dá)增高，提示Treg細(xì)胞通過分泌IL-10抑制牙周組織的炎癥進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)。

綜上所述，在重度慢性牙周炎的病損組織中，Treg細(xì)胞可能通過分泌抑炎性細(xì)胞因子IL-10參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。值得注意的是，盡管在重度慢性牙周炎牙齦組織中Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，但牙周支持組織病損并未得到有效控制，分析可能的原因如下：一方面是重度慢性牙周炎的病損微環(huán)境中除抑炎性細(xì)胞因子IL-10之外，還含有其他促炎性細(xì)胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α等，促炎因子的高水平表達(dá)可能抑制了Treg細(xì)胞對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)的維持作用，削弱了Treg細(xì)胞的細(xì)胞效能[22]。另一方面雖然牙齦組織中Treg細(xì)胞表達(dá)水平增高，但一部分活化增殖的Treg細(xì)胞可能尚未發(fā)育完全，不能有效控制病原體，同時(shí)病損牙周破壞較為嚴(yán)重，發(fā)育成熟的Treg細(xì)胞所發(fā)揮的效能不足以有效控制炎癥，導(dǎo)致炎癥進(jìn)展[23]。