張曉峰，欒培賢，戶國(guó)

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

鯉Cyprinus carpio L.在我國(guó)分布最廣，養(yǎng)殖量在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占很大的比重[1]，是最重要的淡水魚類之一。近年來(lái)，我國(guó)開(kāi)展了大量鯉遺傳改良的分子遺傳學(xué)研究，生長(zhǎng)和食物轉(zhuǎn)化率作為魚類遺傳改良的兩個(gè)主要的生產(chǎn)性能，已取得很多有價(jià)值的研究進(jìn)展[2-7]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，飼料費(fèi)用約占總產(chǎn)值的65%～75%[8-10]，食物轉(zhuǎn)化率是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，迫切需要改良現(xiàn)有水產(chǎn)養(yǎng)殖種類的食物轉(zhuǎn)化效率，節(jié)約飼料費(fèi)用。食物轉(zhuǎn)化率是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多種因素影響，但遺傳基礎(chǔ)即基因起決定性作用[11-14]。找到重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的標(biāo)記或基因，對(duì)此進(jìn)行分子遺傳改良，將增強(qiáng)對(duì)數(shù)量性狀的遺傳操控能力，使數(shù)量性狀的優(yōu)良基因在育種中有目的地聚合或替代，提高育種效率。但水產(chǎn)動(dòng)物的個(gè)體食物轉(zhuǎn)化率性狀難于測(cè)量，很多水產(chǎn)養(yǎng)殖種都沒(méi)有開(kāi)展相關(guān)的分子育種工作，僅在鯉中有少量報(bào)道[7,15,16]。近年來(lái)，本研究團(tuán)隊(duì)利用遺傳連鎖圖譜QTL 定位分析和關(guān)聯(lián)分析，獲得了食物轉(zhuǎn)化率相關(guān)的QTL 和候選基因[17,18]，但是，鯉食物轉(zhuǎn)化率候選基因的相關(guān)機(jī)理研究仍然沒(méi)有開(kāi)展。

明確解析鯉攝食和食物轉(zhuǎn)化率的調(diào)控機(jī)理對(duì)其養(yǎng)殖業(yè)意義重大，隨著高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL 精細(xì)定位，使得候選基因精確定位成為可能。本文利用高密度遺傳連鎖圖譜通過(guò)QTL 精細(xì)定位獲得了食物轉(zhuǎn)化率相關(guān)候選基因（Free fatty acids receptor 3，ffar3）。本研究通過(guò)鑒定分析該基因的序列和結(jié)構(gòu)，探究鯉ffar3 基因組織特異性表達(dá)模式及攝食對(duì)該基因mRNA 表達(dá)水平的影響，為闡明ffar3基因的作用機(jī)理和作用通路，探討這些基因在鯉攝食調(diào)控中的作用，提供客觀證據(jù)和研究基礎(chǔ)，更好地應(yīng)用于鯉食物轉(zhuǎn)化率和生長(zhǎng)性狀的選擇育種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)用健康1 齡鯉，體質(zhì)量約200 g，采自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站；攝食實(shí)驗(yàn)在黑龍江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將40 尾實(shí)驗(yàn)魚（試驗(yàn)需20 尾）在40 個(gè)水族箱中飼養(yǎng)2 周，每天上、下午投喂2次。2 周后，正常投喂后開(kāi)始采樣（投喂后10 min 之內(nèi)），進(jìn)食0 h（對(duì)照組）、2 h、4 h 和6 h 分別取樣5尾，用MS-222 麻醉后，解剖取適量腦、腸、肝臟和肌肉等新鮮組織，迅速投入RNAlater（Qiagen）中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鯉總RNA 的提取

采用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit 組織提取試劑盒（Qiagen），參照標(biāo)準(zhǔn)流程提取試驗(yàn)樣本的RNA。提取后的RNA 經(jīng)Nanodrop8000 檢測(cè)RNA 純度及濃度，1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)其完整性符合質(zhì)量要求后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因生物信息學(xué)分析

利用核酸序列在線分析工具Expasy（https://web.expasy.org/translate/）預(yù)測(cè)基因的開(kāi)放閱讀框及氨基酸序列；利用Expasy 在線工具中的ProtParam程序（https://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和分子量信息；利用在線工具SignalP 5.0（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列；利用cluster x1.83 軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，分析氨基酸同源性；利用SMART 在線分析軟件[19]（http://smart.embl.de/smart/）分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能。應(yīng)用MEGA 4.0 軟件進(jìn)行1 000 次bootstraps 值驗(yàn)證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用MEGA 4.0[20]中的Neighbor-Joining 法構(gòu)建，重復(fù)10 000 次。

1.4 基因表達(dá)的定量分析

1.4.1 第一鏈cDNA 的合成

用SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒（Invitrogen）合成第一鏈cDNA，每個(gè)反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄1 μg 總RNA，按照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，合成的cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)ffar3 基因的mRNA 序列，利用軟件Primer 5.0，綜合考慮熒光定量PCR 引物的設(shè)計(jì)原則，結(jié)合鯉全基因組比對(duì)分析，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物用于定量PCR 擴(kuò)增，內(nèi)參基因?yàn)轷帵?actin（表1）。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.4.3 基因組織表達(dá)的定量分析方法

首先進(jìn)行普通PCR 檢測(cè)，確保PCR 產(chǎn)物條帶單一，無(wú)引物二聚體，并將引物擴(kuò)增片段回收、測(cè)序，以確保所擴(kuò)增的目的片段為鯉ffar3 基因，再用熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。定量PCR 試劑盒為One Step SYBRPrime ScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa），按照操作說(shuō)明步驟，使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI）進(jìn)行Real-Time PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq TM（2×）10 μL，正向及反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 mL，模板cDNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為兩步法程序：95 ℃預(yù)變性10 s；擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95 ℃變性5 s、58℃退火34 s。反應(yīng)結(jié)束后，溶解曲線的反應(yīng)條件為：95 ℃持續(xù)15 s，58 ℃持續(xù)1 min，95 ℃持續(xù)15 s。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次取均值，PCR 反應(yīng)結(jié)束后，使用ABI 7500 熒光定量PCR 儀自帶軟件包分析溶解曲線，計(jì)算△CT 值，以對(duì)照樣組樣品為參照子（calibrator）計(jì)算相應(yīng)的△△CT。最后計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)差異相對(duì)于內(nèi)參因子基因表達(dá)的倍數(shù)[21]。所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ffar3 基因的cDNA 序列分析和推導(dǎo)的氨基酸序列

鯉ffar3 基因（KTG39201.1；鯉ID：CAFS_CommonC_G_004020，V2.0）位于鯉全基因組裝配圖譜scaffold290 上，全長(zhǎng)序列為3 318 bp，具有一個(gè)長(zhǎng)度為990 bp 的完整開(kāi)放式閱讀框（457～1 446 bp），編碼329 個(gè)氨基酸。其N 末端有一個(gè)長(zhǎng)22 殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)肽，信號(hào)肽序列MAWTVSLSNLVLAVYGF TLITG（1～22 aa）（圖1）。預(yù)測(cè)FFAR3 編碼蛋白的分子量約為37.83 kD、理論等電點(diǎn)（PI）為9.10。TMHMMServer v2.0 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該基因含有7 個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，分別為TM1（10～32 bp）、TM2（45～67 bp）、TM3（82～104 bp）、TM4（125～147 bp）、TM5（184～206 bp）、TM6（219～241 bp）和TM7（256～278 bp）（圖2）。不穩(wěn)定系數(shù)為47.03，提示該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為101.91，親水性系數(shù)為0.462，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。

2.2 鯉ffar3 基因與其他物種的序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用鯉ffar3 序列在NCBI 中BLAST 獲得已知其他物種的ffar3 基因的同源序列，包括人（Homo sapiens，XP_011525160.1）、牛（Bos taurus，XP_015313546.1）、小鼠（Mus musculus，NP_001028488.1）、大鼠（Rattus norvegicus，XP_017444965.1）、鯨（Globicephala melas，XP_030730408.1）、黑猩猩（Pan troglodytes，XP_001159667.1）雞（Gallus gallus，XP_025002082.1）、豬（Sus scrofa，NP_001302530.1）、非洲爪蟾（Xenopus tropicalis，XP_002938261.3）、江豚（Neophocaena asiaeorientalis，XP_024589790.1）、斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus，XP_017308220.1）、斑馬魚（Danio rerio，XP_017206922.1）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis，XP_008321219.1）、牙鲆（Paralichthys olivaceus，XP_019964450.1）、青鳉（Oryzias melastigma，XP_024151711.1）、劍尾魚（Xiphophorus couchianus，XP_027869468.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，XP_021427435.1）和大刺鰍（Mastacembelus armatu，XP_026156454.1）等共18 個(gè)基因的蛋白序列。同時(shí)下載尼羅羅非魚（Oreochromis niloticu，XP_019219832.1）ffar2（free fatty acid receptor 2-like）基因作為構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的外類群（outgroup）。

用Cluster W 軟件對(duì)多物種FFAR3 氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)果表明，7 個(gè)跨膜螺旋區(qū)同源性較高，其他部分序列差異較大。本研究獲得的鯉ffar3基因蛋白序列與斑馬魚的序列相似性最高，同源性達(dá)94.19%；與人類、小鼠、半滑舌鰨、虹鱒、斑點(diǎn)叉尾、牙鲆、大刺鰍及青鳉等物種相似性差異不大，同源性介于70.37%～78.46%之間；與鯨和江豚相似性最低，分別為65.99%和66.41%。除去四種哺乳動(dòng)物（人、小鼠、鯨和江豚），其他魚類之間氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果表明，少數(shù)幾個(gè)相似性在80%以上，其他均介于66%～80%之間，物種間相似度相差不大（表2）。

圖1 鯉ffar3 基因的DNA 全長(zhǎng)序列及氨基酸推導(dǎo)序列Fig.1 The full-length DNA and deduced amino acids of ffar3 in common carp Cyprinus carpio

基于9 種硬骨魚類、8 種哺乳動(dòng)物、雞及非洲爪蟾等19 個(gè)ffar3 的氨基酸序列，用羅非魚ffar2 基因作為外類群（outgroup），使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建ffar3 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。由圖3 可知，所有硬骨魚類ffar3 基因與哺乳動(dòng)物的ffar3 基因分屬于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的2 個(gè)分支。硬骨魚類分支中，不同物種形成兩個(gè)亞支。鯉ffar3 基因聚在斑馬魚、劍尾魚、半滑舌鰨和斑點(diǎn)叉尾的ffar3 基因的分支中，而鯉和斑馬魚ffar3 基因親緣關(guān)系最近，聚在一起。牙鲆、青鳉和大刺鰍聚在一起。雞和非洲爪蟾的ffar3 基因單獨(dú)呈一支。

圖2 ffar3 基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of protein deduced by the ffar3 gene

2.3 鯉ffar3 基因的組織表達(dá)分析

熒光定量RT-PCR 結(jié)果顯示，攝食后鯉腦、腸和肌肉中ffar3 基因mRNA 表達(dá)水平均有顯著變化，而肝臟中變化不顯著；鯉攝食2 h 時(shí)，該基因在腦中表達(dá)量最高，在進(jìn)食后6 h 時(shí)小腸中表達(dá)量最高?？v觀四種組織，ffar3 基因在腸組織中表達(dá)量最高，肌肉和腦次之，而在肝表達(dá)量最小?；虮磉_(dá)量差異顯著的三種組織在進(jìn)食后不同時(shí)間表達(dá)量差異顯著。腦組織中，進(jìn)食2 h 時(shí)基因表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的推移，4 h 和6 h 基因表達(dá)量遞減。而腸和肌肉中，進(jìn)食后2～6 h 基因表達(dá)量升高，在6 h 時(shí)表達(dá)量最高。在肌肉中的情況與腸相似，也是隨著進(jìn)食時(shí)間的推移，表達(dá)量上升，只是表達(dá)量升高的幅度較腸?。▓D4）。

表2 魚類和其他物種FFAR3 氨基酸序列比對(duì)（%）Tab.2 Comparison of the identities and divergence of the FFAR3 amino acid sequences between the fish and other species

圖3 鯉ffar3 氨基酸進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequence of the ffar3 gene in common carp Cyprinus carpio

圖4 ffar3 基因在鯉不同組織中的mRNA 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of mRNA ffar3 gene in different tissues of common carp Cyprinus carpio

3 討論

自由脂肪酸受體FFAR3 也被稱為G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-Coupled Receptor 41，GPR41），首先被發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物腸道中[23,24]。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收調(diào)控的關(guān)鍵步驟是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的感知，G 蛋白偶聯(lián)受體FFAR3具有這一功能。FFAR3 為脂肪酸感受器，可以感知來(lái)自消化腔的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等，由腸道微生物發(fā)酵膳食纖維和前腸未消化的碳水化合物生成，是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的能量來(lái)源[25]。FFAR3 作為一種重要的信號(hào)分子可調(diào)控脂類代謝、腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及與細(xì)胞的分化和增殖密切相關(guān)的生理過(guò)程[23-25]。Samuel 等[25]研究表明：ffar3 基因敲除,小鼠腸道食糜通過(guò)腸道時(shí)間延長(zhǎng)，短鏈脂肪酸吸收減少。Solima 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，敲除ffar3 基因后，短鏈脂肪酸減少，采食量和能量消耗增加，體重減輕。一些研究還發(fā)現(xiàn)，ffar3 基因具有調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂肪形成的作用。Meza-Cuenca 等[27]發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠腹部脂肪細(xì)胞中ffar3 基因的mRNA 的表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加，說(shuō)明其在脂肪形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Zaibi 等[28]在小鼠中也得出了相似的結(jié)論。

近年來(lái)，ffar3 基因的功能在家畜中也有一些研究報(bào)道。Inoue 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAR3 等短鏈脂肪酸能為反芻動(dòng)物提供75%的能量，可激活FFAR3 調(diào)節(jié)脂肪代謝。郝軍等[30]在研究牦牛ffar3 基因?qū)ιL(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ffar3 基因不同基因型對(duì)牦牛體質(zhì)量和體高有顯著作用。李根來(lái)等[31]研究表明，豬ffar3 在不同組織、不同發(fā)育階段表達(dá)量呈明顯的時(shí)間特異性，揭示其可能在不同發(fā)育階段和不同組織中發(fā)揮重要的生理功能。在家畜中，還有較多研究集中在組織表達(dá)特異性方面[32-35]。

但ffar3 基因在魚類中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)前期高密度遺傳連鎖圖譜精細(xì)定位獲得的候選基因，定位了ffar3 為食物轉(zhuǎn)化率相關(guān)的候選基因，通過(guò)鯉全基因組物理圖譜和轉(zhuǎn)錄組圖譜獲得了該基因的全長(zhǎng)序列。鯉ffar3 基因全長(zhǎng)序列為3 318 bp，具有一個(gè)長(zhǎng)度為990 bp 的完整開(kāi)放式閱讀框（457～1 446 bp），編碼329 個(gè)氨基酸，與斑馬魚（編碼327 個(gè)氨基酸）、斑點(diǎn)叉尾（編碼325 個(gè)氨基酸）、牙鲆（編碼325 個(gè)氨基酸）等基本一致，可判斷其cDNA 的完整性。多個(gè)物種的氨基酸同源性分析表明，鯉ffar3 基因與其他魚類同源性較高，其中與斑馬魚ffar3 基因的同源性最高，達(dá)94.19%。尤其是7 個(gè)跨膜螺旋區(qū)域同源性更高，表明ffar3 基因相對(duì)保守，這與Wang 等[36]的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，魚類ffar3 基因親緣關(guān)系較近，所有硬骨魚類ffar3 基因聚在一支，而哺乳動(dòng)物則聚在另一支。

本文通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析，檢測(cè)到鯉ffar3在腦、腸、肌肉和肝臟中均有表達(dá)，腸中表達(dá)量最高，這與前人在ffar3 在人[36]、豬[31]、山羊[34]和奶牛[38]等組織的表達(dá)結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)食后時(shí)間的不同，除了肝臟外，其他三種組織mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯差異。腦中在進(jìn)食后2 h 基因表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后在進(jìn)食后4 h 和6 h 呈下降趨勢(shì)。而在腸中則隨著進(jìn)食時(shí)間的延遲，基因表達(dá)量逐漸升高，在進(jìn)食6 h 達(dá)到最高。肌肉的表達(dá)趨勢(shì)與腸一致，但基因表達(dá)量升高的幅度小于腸組織。這些結(jié)果表明：ffar3 基因與攝食相關(guān)，暗示該基因可能參與了食物轉(zhuǎn)化和吸收相關(guān)的生理過(guò)程。本研究?jī)H在四種組織中探究了基因的表達(dá)情況，還需在多種組織中進(jìn)一步驗(yàn)證。由于食物轉(zhuǎn)化率性狀是一個(gè)多基因控制的性狀，單獨(dú)研究一個(gè)基因還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要不斷挖掘更多的相關(guān)候選基因來(lái)分析表達(dá)差異，建立起基因功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以用于提高魚的食物轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)魚類快速生長(zhǎng)。