孫志鵬 ，呂偉華，黨紅陽(yáng),2，曹頂臣，匡友誼，魯翠云，鄭先虎

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚(yú)類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 (CCAAT enhancer binding protein,C/EBP) 是堿性區(qū)亮氨酸拉鏈(basic region／leucine zipper，Bzip)蛋白家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[1]。C/EBP 轉(zhuǎn)錄因子包含一個(gè)高度保守的DNA 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈二聚體結(jié)構(gòu)域，形成同源或異源二聚體結(jié)合到相似的序列上[2]。其中，C/EBPα 在脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝臟、肺及胎盤等多種細(xì)胞或組織中均有表達(dá)[3-5]，具有調(diào)控細(xì)胞分化、參與能量代謝、抑制細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)功能[6]，脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中控制動(dòng)物腹腔脂肪沉積的主效基因或與主效基因緊密連鎖。Lekstrom 和Xanthopoulos[7]發(fā)現(xiàn)：C/EBPα 基因的過(guò)表達(dá)能加速前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，在大多數(shù)特異性脂肪細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄之前表達(dá)。Yeh 等[8]和Rosen 等[9]揭示，C/EBPα 在脂肪細(xì)胞分化的終末階段大量表達(dá)，與過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ）共同作用，開(kāi)啟一系列脂肪特異性基因的表達(dá)，合成、攝取和儲(chǔ)存長(zhǎng)鏈脂肪酸，使細(xì)胞停止增殖，呈現(xiàn)完全分化狀態(tài)。

目前，關(guān)于C/EBPα 與脂肪沉積關(guān)系的研究主要集中在哺乳動(dòng)物和畜禽方面。Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：小鼠C/EBPα 基因表達(dá)受到干擾后，腹部脂肪沉積明顯下降。Lee 等[11]研究顯示，敲除C/EBPα 基因后，小鼠喪失了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因功能，影響糖代謝和脂肪生成。耿蓓等[12]研究表明，高脂飲食會(huì)抑制小鼠血液中C/EBPα 的表達(dá)。張愛(ài)朋等[13]比較了C/EBPα 突變?nèi)怆u與未突變個(gè)體發(fā)現(xiàn)，突變個(gè)體腹脂含量及腹脂率顯著高于未突變個(gè)體。然而，C/EBPα 基因在魚(yú)類中卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)克隆鯉Cyprinus carpio C/EBPα 基因全長(zhǎng)cDNA 序列，并將其編碼氨基酸序列與其他物種進(jìn)行了同源性多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析，研究C/EBPα 基因在鯉不同組織中及其在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征，以期為深入研究C/EBPα 基因在鯉脂肪細(xì)胞分化及脂肪發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)5 尾為1 齡魚(yú)，體質(zhì)量200～250 g，取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站同一養(yǎng)殖池塘，禁食24 h 后，采集腹腔脂肪（脂肪組織）、腦組織、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、腹部肌肉、腸組織和血液等樣本，迅速放入液氮中保存?zhèn)溆?；依次采集鯉受精卵期? 細(xì)胞期、囊胚晚期、原腸胚晚期、7 體節(jié)期、心跳期、體循環(huán)期、出膜期、開(kāi)口期和出苗5 d 等10 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期胚胎樣本，保存于液氮中備用。

1.2 基因全長(zhǎng)cDNA 獲得

參照RNeasy Min Elute Clean up Kit（QIAGEN）試劑盒說(shuō)明提取總RNA，使用Prime ScriptTMRT reagent Kit 試劑盒合成cDNA 第一鏈。從NCBI 檢索并下載斑馬魚(yú)等硬骨魚(yú)類C/EBPα 基因的cDNA 序列，選擇保守區(qū)域與鯉轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得鯉C/EBPα 基因部分cDNA 序列，并設(shè)計(jì)同源簡(jiǎn)并引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，PCR 產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T（TaKaRa）載體,轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽(yáng)性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，獲得C/EBPα 基因核心片段序列。參照SeqAmpTMDNA Polymerase（Clontech）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行5’/3’端RACE 擴(kuò)增，以獲得非編碼區(qū)（UTR）序列。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST（https://www.n cbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)、DNAMAN 分析和Staden（1.7）拼接，最終獲得C/EBPα 基因的全長(zhǎng)cDNA 序列[14]。

1.3 基因序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ExPASy（https://www.expasy.org/proteomics）等在線軟件分析信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白疏水性及脂肪系數(shù)等蛋白特征。使用MEGA6.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootsrap 值取1 000 次，由JTT 距離矩陣模型（JTT matrix-based method）計(jì)算進(jìn)化距離[ 15 ]。

1.4 基因表達(dá)特征分析

參照測(cè)序后獲得的C/EBPα 基因全長(zhǎng)cDNA 序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,以鯉18S 為內(nèi)參基因，參照One Step SYBRPrime ScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa）試劑盒使用方法，利用ABI 7500 Real-time PCR 定量?jī)x，測(cè)定了鯉不同組織間和不同胚胎發(fā)育時(shí)期C/EBPα 基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。采用2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 17.0 單因素方差分析（one-way ANOVA）分析了基因相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性，差異顯著性水平P＜0.05，差異極顯著性水平P＜0.01[16]。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉C/EBPα 全長(zhǎng)cDNA 序列分析

采用RACE 擴(kuò)增方法獲得C/EBPα 基因的cDNA 全長(zhǎng)總長(zhǎng)為1 463 bp 的鯉C/EBPα（GenBank 登錄號(hào)：MN073500）。其中，234 bp 的5’端非編碼區(qū)（5’-UTR），861 bp 的開(kāi)放閱讀框（編碼286 個(gè)氨基酸）和368 bp 的3’端非編碼區(qū)（內(nèi)含30 bp 的polyA尾巴），polyA 上游176 bp 處存在一個(gè)“ACTAAA”加尾信號(hào)。

經(jīng)ExPASy 的ProtParam 工具預(yù)測(cè)蛋白分子式為C1409H2210N426O438S13，總原子數(shù)為4 496 個(gè)。蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為32.5 kD，理論P(yáng)I 值7.02；不穩(wěn)定系數(shù)為52.48，蛋白穩(wěn)定性較低；脂肪系數(shù)為63.50，親水性平均系數(shù)為-0.962。氨基酸預(yù)測(cè)分析表明，脯氨酸含量最高（8.0%），不含色氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺共帶負(fù)電荷殘基總數(shù)36個(gè)，精氨酸和賴氨酸帶正電荷殘基總計(jì)35 個(gè)。

2.2 氨基酸序列多重比較與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

圖2 基于不同物種C/EBPα 氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on C/EBPα amino acid sequences of different species

利用CLUSTAL 2.1 在線分析軟件對(duì)鯉C/EBPα 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，其與斑馬魚(yú)Danio rerio、大西洋鮭Salmo salar、小鼠Mus musculus 氨基酸序列的相似性分別為93.36%、63.64%和52.47%。多重比較結(jié)果顯示，6 個(gè)物種間C/EBPα 氨基酸序列同源性的差異主要集中在C-端的多肽上（圖1）。

基于23 個(gè)物種C/EBPα 氨基酸序列，采用MEGA 6 軟件，用N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，全部魚(yú)類聚為一大支，其中鯉、鯽、斑馬魚(yú)等鯉科魚(yú)類聚為一支；虹鱒、大西洋鮭等鮭科類魚(yú)聚為一支；牙鲆Paralichthys olivaceus、半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis 等鲆鰈類魚(yú)聚為一支，哺乳動(dòng)物聚為另一大支（圖2）。

2.3 C/EBPα 基因在鯉不同組織表達(dá)特征

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，C/EBPα 基因在實(shí)驗(yàn)組織中均有表達(dá)（圖3），9 個(gè)組織中基因相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為：脂肪、腸、腦、脾、肝、腎、心臟、血液和腹部腹肌。脂肪的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)高于其他組織，且差異極顯著(P＜0.01)；腦、脾、肝和腎組織中的表達(dá)量相當(dāng)，無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.4 C/EBPα 基因鯉不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)特征

圖3 C/EBPα 基因在鯉不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of C/EBPα gene in different tissues of common carp C.carpio

圖4 鯉不同胚胎發(fā)育時(shí)期C/EBPα 基因的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative expression levels of C/EBPα gene in different embryonic stage of common carp C.carpio

C/EBPα 基因在鯉胚胎不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量變化情況見(jiàn)圖4。由圖4 可知，受精后至心跳期，隨著胚胎的發(fā)育，C/EBPα 基因的表達(dá)量逐漸上升，心跳期表達(dá)量最高，相對(duì)其他時(shí)期差異極顯著（P＜0.01）。心跳期后基因表達(dá)量顯著下降，出膜期后C/EBPα基因表達(dá)量有所升高。

3 討論

自1989 年被發(fā)現(xiàn)至今，大量預(yù)測(cè)研究表明，C/EBPα 蛋白也位于細(xì)胞核內(nèi)，屬于b-Zip 家族，具有典型亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)[17,18]。不同物種間C/EBPs 轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合域和激活域高度同源，尤其是DNA 結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中變異率極低。小鼠C/EBPα 基因編碼區(qū)長(zhǎng)度約1 188 bp，編碼395 個(gè)氨基酸[11]，秦川牛基因編碼區(qū)長(zhǎng)度1 062 bp，編碼353 個(gè)氨基酸[19]，雞C/EBPα 基因編碼區(qū)長(zhǎng)度約1 300 bp[20]，朗德鵝基因編碼區(qū)長(zhǎng)度約975 bp，編碼324 個(gè)氨基酸[21]。本研究克隆了鯉C/EBPα 基因全長(zhǎng)，開(kāi)放閱讀框861 bp，共編碼286 個(gè)氨基酸，編碼氨基酸數(shù)較哺乳動(dòng)物和畜禽類少。鯉C/EBPα 基因編碼氨基酸序列與斑馬魚(yú)相似度為93.36%，而與人相似度僅為52.47%，可見(jiàn)物種間差異較大。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物聚為一大支，魚(yú)類聚為一大支，鯉科魚(yú)類聚為一小支，說(shuō)明C/EBPα 基因在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。盤道興等[22]研究表明，C/EBPα基因在豬皮下脂肪中表達(dá)量最高，肝和小腸中表達(dá)較高，心和腎中表達(dá)量最低，與本研究結(jié)果相近，說(shuō)明在豬和鯉組織中C/EBPα 基因表達(dá)量與脂肪細(xì)胞的實(shí)際分布成正比。

大多數(shù)魚(yú)類在饑餓狀態(tài)下優(yōu)先動(dòng)用脂肪作為能量來(lái)源[23,24]，而且對(duì)脂肪的利用能力很高，其用于機(jī)體增重和分解供能的總利用率達(dá)90%以上[25]。C/EBPα 在脂肪細(xì)胞分化、發(fā)育過(guò)程中起決定作用，眾多脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)的基因都含有C/EBPα 的結(jié)合位點(diǎn)，可激活大部分脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)基因，如磷酸烯醇丙酮酸羧基酶（PEPCK）基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）-4 基因及瘦素（leptin）等的調(diào)控區(qū)域，從而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞中脂肪的積累[26,27]。脂肪沉積主要通過(guò)脂肪細(xì)胞數(shù)量增多和體積增大來(lái)實(shí)現(xiàn)。韋璇等[28]發(fā)現(xiàn)，C/EBPα 基因表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)脂肪細(xì)胞體積增大，導(dǎo)致阿勒泰羊尾部脂肪沉積。然而對(duì)魚(yú)類脂肪性狀的研究，應(yīng)系統(tǒng)探究脂肪沉積、脂肪分解、脂肪酸的形成等，單純孤立研究某一個(gè)或兩個(gè)基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要更多地發(fā)掘魚(yú)類的脂質(zhì)產(chǎn)生與代謝相關(guān)基因表達(dá)的差異，從整體上把握這些基因控制魚(yú)類脂肪性狀的相關(guān)性，清楚地了解魚(yú)類脂肪性狀的控制機(jī)制。