歐陽秋麗， 萬益群*，2

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.江西省現(xiàn)代分析科學(xué)重點實驗室，江西南昌 330031)

多效唑是一種抑制類的植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠延緩植物生長、抑制莖桿伸長、改善果品品質(zhì)，提高其產(chǎn)量，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中[1 - 5]。然而，多效唑與其它農(nóng)藥一樣，如若超過一定劑量，將會對人體健康造成一定危害[6]。多效唑在土壤中易被吸附，其殘留物會污染附近的水體，進(jìn)而可能危及人類和動物的健康，并影響土壤微生物的活動[7]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)假單胞桿菌作用96 h后，多效唑的降解產(chǎn)物會產(chǎn)生致突變性[8,9]。另有研究表明，一定劑量的多效唑?qū)游镄坌陨称鞴儆袚p傷，子代體重和繁殖指數(shù)降低，肝臟受損，有可能是致癌物質(zhì)，且多效唑粉劑對皮膚和眼睛有輕微至中等程度的刺激作用[10]。為此，許多國家和地區(qū)對多效唑的最大殘留制定了一系列標(biāo)準(zhǔn)。如日本規(guī)定梨、梅、油桃、杏仁中多效唑的最大殘留量為500 ng/mL；我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2014)中規(guī)定，食品中多效唑殘留量：稻谷、小麥、油菜籽、花生仁、蘋果均為500 ng/mL。因此，開展食品中多效唑殘留快速檢測新技術(shù)研究，對食品安全生產(chǎn)、現(xiàn)場監(jiān)督都具有十分重要的現(xiàn)實意義。

目前，多效唑的檢測方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等[11 - 13]。這些方法精密度和準(zhǔn)確度都較高，但檢測成本高、樣品前處理復(fù)雜，并需要專業(yè)的技術(shù)人員操作，且不適合現(xiàn)場快速檢測。免疫分析法是基于抗原抗體的高度特異性結(jié)合，因此具有很高的選擇性和靈敏度[14 - 16]。與色譜等分析技術(shù)相比，免疫分析法樣品前處理簡單、樣品用量少，適用于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測[17 - 19]。劉香香等人建立了抗多效唑多克隆抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ic -ELISA)，該方法選擇性好、靈敏度較高，適用于大批量樣品的現(xiàn)場檢測[20]。但多克隆抗體的制備均一性較差，背景干擾大，且有時存在交叉反應(yīng)。相比于多克隆抗體，基于雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)的單克隆抗體具有很高的特異性，可低成本、連續(xù)生產(chǎn)性能一致的抗體。長期以來，小分子抗原免疫分析體系的靈敏度主要依賴于所獲單抗的親和力性能，然而抗體親和力的定向提升目前仍是世界性的難題。本研究在獲得多效唑單克隆抗體的基礎(chǔ)上，通過檢測抗原改造的方式來提升免疫分析體系的靈敏度，應(yīng)用本實驗室劉香香等[21]制備的抗多效唑單抗，基于琥珀酸酐法和4-(溴甲基)-苯甲酸法制備了分別具有4個碳和8個碳原子連接臂的多效唑檢測抗原，結(jié)果顯示基于8個碳原子連接臂多效唑檢測抗原的免疫分析體系的靈敏度提升了6倍，為提高多效唑免疫分析體系的靈敏度提供了一種新的策略。在此基礎(chǔ)上，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，構(gòu)建了多效唑的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析新方法，并用于水果中多效唑的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

96孔酶標(biāo)板(深圳金燦華公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器公司)；酶標(biāo)儀(Thermo/芬蘭Labsystems公司)；37 ℃恒溫孵育箱(日本，SANYO)。

多效唑、烯效唑、烯唑醇、己唑醇均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、羊抗鼠IgG -HRP酶標(biāo)二抗均購自sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(中國)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)，N,N′-二環(huán)己基碳酰亞胺(N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide，DCC)，N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)購自北京百靈威科技有限公司。水為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制10×磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L，pH=7.4):NaCl 80 g、KCl 2 g、KH2PO42 g、Na2HPO4·12 H2O 29 g、蒸餾水定容至1 000 mL；1×PBS(0.01 mol/L，pH=7.4):10×PBS稀釋10倍；PBST:10×PBS含0.05% Tween-20；碳酸鹽緩沖液(CBS，0.05 mol/L，pH=9.6):1.59 g Na2CO3、2.93 g NaHCO3、蒸餾水定容至1 000 mL；TMB顯色液：A液：0.018 g乙二胺四乙酸二鈉、0.105 g檸檬酸，定容至30 mL，加入20 mL丙酮溶液(含0.025 g TMB)；B液：0.5 g過氧化脲、2.45 g NaAc·3 H2O、3.0 mL冰HAc，定容至500 mL。使用時A、B液等體積混合。

1.2.2 檢測抗原的制備第一種包被抗原通過琥珀酸酐法制備多效唑半抗原，再采用EDC法使半抗原與OVA偶聯(lián)，制備多效唑全抗原，連接臂長度為4個碳原子，合成路線如圖1。

圖1 琥珀酸酐法合成多效唑全抗原技術(shù)路線Fig.1 Preparation of paclobutrazol artificial antigen by succinic anhydride method

第二種包被抗原通過4-(溴甲基)-苯甲酸法制備多效唑半抗原，再采用DCC法使半抗原與BSA偶聯(lián)，制備多效唑全抗原，連接臂長度為8個碳原子，合成路線如圖2。

圖2 4-(溴甲基)-苯甲酸法制備多效唑全抗原技術(shù)路線Fig.2 Preparation ofpaclobutrazol artificial antigen by 4-(bromomethyl)-benzoic acid method

1.2.3 棋盤滴定法驗證包被抗原與抗體的親和性能采用棋盤滴定法分析包被抗原與抗體的親和性能，具體實驗過程如下：(1)包被：選擇所制備的人工抗原為檢測原包被96孔酶標(biāo)板，用1×PBS配制成4個濃度(8、6、4、2 μg/mL)，每個濃度包被一行，每孔100 μL，再用1 μg/mL的BSA與OVA作為為陰性對照，于37 ℃溫育2 h。(2)封閉：倒掉包被液，PBST洗板三次后，用5%脫脂牛奶封閉板條，每孔300 μL，于37 ℃溫育0.5 h。(3)加單抗：倒掉封閉液，PBST洗板三次，用1×PBS將腹水做稀釋(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000)，以MT2 1∶4 000、MB 1∶4 000、FC 1∶4 000為陰性血清對照，并設(shè)空白對照，每孔100 μL，于37 ℃溫育0.5 h。(4)加二抗：倒掉板內(nèi)液體，PBST洗板三次，每孔加入100 μL 1∶5 000羊抗鼠IgG -HRP酶標(biāo)二抗，于37 ℃溫育0.5 h。(5)顯色：PBST洗板三次，將A、B顯色液等體積混合，每孔加入100 μL，于37 ℃顯色7 min。(6)終止：每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止顯色。在450 nm波長處用酶標(biāo)儀讀取OD值。選取OD450數(shù)值為0.8～1.5時的抗原濃度為最佳抗原包被濃度，對應(yīng)的抗體稀釋度為抗體效價。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于不同檢測抗原的多效唑免疫分析性能

應(yīng)用基于琥珀酸酐法合成的檢測抗原包被96孔酶標(biāo)板，操作同“1.2.3”部分，結(jié)果見表1。從表1可看出，當(dāng)包被濃度為6 μg/mL時，效果較好，抗體效價為32 000。

表1 基于琥珀酸酐法合成包被抗原的ELISA棋盤測定結(jié)果Table 1 ELISA checkerboard assay for coated antigen based on succinic anhydride method

采用ic -ELISA方法測定基于琥珀酸酐法合成包被抗原的免疫分析體系的靈敏度。選用棋盤滴定方法確定的最佳工作濃度，同時每孔分別加入50 μL的0、400、800、1 200 、1 600、2 000、2 400 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液(溶于10%甲醇-PBS中)，及50 μL的抗體(取效價測定時OD450為0.8～1.5左右的稀釋度的2倍)做ic -ELISA，同時設(shè)置空白對照，其他操作同棋盤測定法，檢測OD450。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，B/B0值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可得基于琥珀酸酐法合成包被抗原的ic-ELISA的Ic50值為505.2 ng/mL。

采用基于4-(溴甲基)-苯甲酸法合成的檢測原包被96孔酶標(biāo)板，其余操作同第一種檢測原。結(jié)果表明，當(dāng)檢測原濃度為0.4 μg/mL時，抗體效價為1∶160 000，Ic50值為78.5 ng/mL。由此可見，通過4-(溴甲基)-苯甲酸法制備多效唑半抗原，再采用DCC法使半抗原與BSA偶聯(lián)制備的人工抗原為檢測原時，所建立的ic-ELISA體系靈敏度更高。這可能是該檢測原與免疫原結(jié)構(gòu)差別更大，從而降低了檢測原與抗體的結(jié)合，使得抗體與抗原的特異性結(jié)合增加，從而提高了該ic -ELISA體系的靈敏度。

2.2 基于抗多效唑單克隆抗體的多效唑ELISA方法的建立

2.2.1 分析條件的優(yōu)化分別對檢測抗原包被液、包被條件、離子強(qiáng)度、緩沖液pH、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與競爭模式等實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化。

采用所選擇的檢測原包被96孔酶標(biāo)板，分別用1×CBS、1×PBS作為包被液與抗體稀釋液做競爭反應(yīng)，測得抗體在該條件下Ic50分別為133.6 ng/mL和78.5 ng/mL，表明PBS比CBS更適宜該抗體與抗原的特異性反應(yīng)，故選擇1×PBS為包被液。

選擇37 ℃包被2 h、3 h與4 ℃包被過夜，測得的Ic50分別為78.0 ng/mL、84.4 ng/mL、97.5 ng/mL。結(jié)果表明，溫育比4 ℃包被過夜的靈敏度更高，且隨著溫育時間的延長，其OD值會有所上升，但是Ic50也會有所提高。最終選擇37 ℃包被2 h。

基于以上的優(yōu)化，緩沖液離子強(qiáng)度分別選擇1×PBS、5×PBS、10×PBS，其Ic50分別為78.5 ng/mL、98.6 ng/mL、80.1 ng/mL，雖然10×PBS與1×PBS的半抑制濃度相差不大，但是離子強(qiáng)度過大，會影響蛋白原性，從而影響特異性結(jié)合，故選擇1×PBS。

選擇不同pH(5.5、6.5、7.4、8.5)的1×PBS進(jìn)行實驗，測得Ic50分別為73.4 ng/mL、82.9 ng/mL、78.5 ng/mL、76.2 ng/mL。但是，相同稀釋度的抗體在pH=5.5、8.5的OD值均較低，由此可知該抗體在中性條件下更穩(wěn)定，故選擇1×PBS(pH=7.4)作為反應(yīng)緩沖液。

分別以板外競爭與板內(nèi)競爭兩種模式進(jìn)行ic-ELISA反應(yīng)。板外競爭，即將抗體與標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，在封閉的酶標(biāo)板中反應(yīng)30 min，再將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至用檢測原包被的板條中反應(yīng)30 min。結(jié)果表明，板外競爭Ic50=69.2 ng/mL、板內(nèi)競爭Ic50=78.5 ng/mL，二者Ic50相差不大，且板外競爭中抗體與標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移過程中會造成損失，導(dǎo)致最終OD值偏小，故選擇板內(nèi)競爭模式。

圖3 最優(yōu)條件下的間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Indirect competition standard curve under optimal conditions

分別選擇5%甲醇-PBS、10%甲醇-PBS、15%甲醇-PBS和20%甲醇-PBS為標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液，其Ic50值分別為71.8 ng/mL、78.5 ng/mL、54.0 ng/mL和87.3 ng/mL。結(jié)果表明，甲醇濃度過低或者過高都會使Ic50值偏高，這是由于當(dāng)甲醇濃度過低時，標(biāo)準(zhǔn)品溶解不完全，但是當(dāng)甲醇濃度過高時，會影響蛋白原性。最終選擇15%甲醇-PBS為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

在上述優(yōu)化的實驗條件下，以結(jié)合率B/B0(y)為縱坐標(biāo)、濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-21.07lnc+134.19，線性相關(guān)系數(shù)為0.9923，Ic50為54 ng/mL，檢測限Ic20：13.4 ng/mL～I(xiàn)c80：212.7 ng/mL。

2.2.2 交叉反應(yīng)分別以多效唑的類似物烯效唑、烯唑醇代替多效唑，濃度均為4 000、2 000、1 000、500、250、125 ng/mL的梯度，ic-ELISA測定它們的Ic50，并按公式計算交叉反應(yīng)率(CR(%)):CR(%)=Ic50(PAC)/Ic50(類似物)×100%，結(jié)果見表2。結(jié)果表明除烯效唑有極小的交叉反應(yīng)外，其余類似物幾乎不與抗體反應(yīng)。

2.2.3 樣品測定準(zhǔn)確稱取10 g左右勻漿好的食品(蘋果、臍橙)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，于迷你振蕩器上振蕩2 min。然后加入5 g無水MgSO4，振蕩2 min后4 000 r/min離心10 min，再將其上清液轉(zhuǎn)移到濃縮瓶中，氮氣吹干。殘留物加1 mL甲醇溶解，取100 μL用PBS稀釋成15%甲醇-PBS進(jìn)行ic -ELISA測定。在上述樣品中分別添加4個不同水平的多效唑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，每個水平平行測定3次，結(jié)果見表3。由表3可知，所分析的樣品中未檢測出多效唑殘留，蘋果、臍橙樣品加標(biāo)回收率分別為83.2%～96.4%、88.9%～94.6%，表明所建立的方法能夠滿足實際樣品分析要求。

表2 多效唑及其類似物的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivity of the paclobutrazol and its analogues

表3 蘋果、臍橙中多效唑加標(biāo)回收結(jié)果(n=3)Table 3 Recovery results of paclobutrazol in apple and navel orange samples(n=3)

3 結(jié)論

在獲得抗多效唑單克隆抗體的基礎(chǔ)上，選擇4-(溴甲基)-苯甲酸法與DCC法制備含8個碳原子連接臂的全抗原作為包被抗原，異源檢測拓寬了檢測原的選擇性。通過包被液、包被時間、緩沖液離子強(qiáng)度、pH、競爭模式和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中有機(jī)溶液含量等反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了基于單克隆抗體的多效唑的ic-ELISA分析新方法。該方法的Ic50=54 ng/mL，低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)500 ng/mL，與多效唑的結(jié)構(gòu)類似物不存在交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。在蘋果和臍橙中的加標(biāo)回收實驗中顯示出較好的方法學(xué)準(zhǔn)確度，所構(gòu)建的方法可應(yīng)用于水果中多效唑的快速檢測。