蔡明蘭， 熊金輝， 郝菊芳， 何保江， 柏正武*

(1.武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430205；2.中國煙草總公司職工進(jìn)修學(xué)院，河南鄭州 450008；3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州 450001)

手性藥物對映體在人體內(nèi)的藥理和生理活性方面往往存在顯著的差異，如一個對映體能治療疾病，而另一個對映體可能會對人體有毒，所以手性化合物(尤其是手性藥物)的對映體分離非常重要[1]。目前基于使用手性固定相(Chiral Stationary Phase，CSP)的高效液相色譜(High-performance Liquid Chromatography，HPLC)法已成為對映體分離分析最有效的方法之一[2,3]。在現(xiàn)有的手性固定相中，以纖維素和直鏈淀粉衍生物制備的涂敷型手性固定相分離性能最佳，但這些手性固定相在正相條件下對流動相的耐受性不強(qiáng)，其流動相的適用范圍受到限制[4 - 6]。因此，研制手性分離性能強(qiáng)且對流動相耐受性好的固定相是手性分離領(lǐng)域中的一項(xiàng)主要工作。

甲殼素和殼聚糖都曾用來制備CSP[7 - 9]，因其衍生物在絕大數(shù)有機(jī)溶劑中難以溶解，所制得的CSP對流動相有良好的耐受性能。但至今為止對殼聚糖衍生物手性固定相的研究仍不夠全面、深入，特別在構(gòu)效關(guān)系方面尤其如此。殼聚糖的2位上連接的是氨基，3位和6位上連接的是羥基，氨基和羥基對酸酐及酰氯的反應(yīng)活性不同，可以對這兩種基團(tuán)進(jìn)行選擇性的修飾[10]，合成出各種不同結(jié)構(gòu)的衍生物?，F(xiàn)已有一些?；瘹ぞ厶茄苌顲SP的報(bào)道[11,12]，但對脲基化殼聚糖衍生物CSP的報(bào)道仍很少。

為發(fā)現(xiàn)分離性能好的脲基化殼聚糖衍生物CSP，以及研究其構(gòu)效關(guān)系，本文以殼聚糖為手性源，將其2位上的氨基轉(zhuǎn)化為芐基脲，再用4-甲基苯基異氰酸酯和4-氯苯基異氰酸酯分別修飾脲基化殼聚糖3位和6位上的羥基，合成出殼聚糖-3，6-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-2-(芐基脲)和殼聚糖-3，6-二(4-氯-苯基氨基甲酸酯)-2-(芐基脲)。以上述兩種殼聚糖衍生物為手性選擇體，制備兩種相應(yīng)的固定相，通過分析檢測，比較這兩種固定相的手性分離性能，考察殼聚糖衍生物中的甲基和氯對分離性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(美國，Waters公司)，配備W600泵、W717自動進(jìn)樣器、996二極管陣列檢測器和Empower色譜工作站；PerkinElmer FT-IR紅外光譜儀(美國，PE公司)；Bruker AVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振儀(瑞士，Bruker公司)；Alltech 1666色譜柱填充泵(美國，Alltech公司)。

殼聚糖按文獻(xiàn)方法[13]制備(脫乙酰度>99%，粘均分子量為1.4×105)。7 μm球形大孔硅膠(日本Daiso公司)；甲殼素(濰坊海之源生物制品有限公司)；N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯甲酸乙酯、甲醇、LiCl、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)和用作色譜流動相的有機(jī)溶劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，在使用前DMAc經(jīng)分子篩(4 ?)干燥三次，LiCl在馬弗爐中于300 ℃下干燥3 h；4-甲基苯基異氰酸酯、4-氯苯基異氰酸酯(濮陽市宏達(dá)圣導(dǎo)新材料有限公司)。

1.2 手性選擇體的制備

以氯甲酸乙酯代替氯甲酸甲酯，按文獻(xiàn)方法[14]合成殼聚糖芐基脲。將2.0 g LiCl和20 mL DMAc相混合，加熱至80 ℃使LiCl完全溶解。向此溶液中加入1.5 g(5.14 mmol)殼聚糖芐基脲，攪拌至固體完全溶解。再向上述殼聚糖芐基脲溶液中加入催化量的DMAP及3.64 g(25.68 mmol)4-甲基苯基異氰酸酯，在90 ℃下反應(yīng)30 h。反應(yīng)結(jié)束后，趁熱將反應(yīng)混合液滴加至200 mL甲醇中得到沉淀物，過濾，干燥。將粗產(chǎn)物溶于20 mL DMF中，再在150 mL甲醇中重沉淀，過濾，干燥。如此重復(fù)若干次，直到收集到的濾液經(jīng)薄層色譜檢測無紫外吸收為止，干燥至恒重，得到殼聚糖-3,6-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-2-(芐基脲)，即CS1，產(chǎn)率為68%。

1H NMR(600 MHz，DMSO-d6，90 ℃，δ/ppm)：9.29～8.59(2H，Ph-NH-CO2)，7.52～6.72(13H，Ph-H)，6.40～5.52(2H，-NH-CO-NH-)，5.17～3.27(9H，氨基葡萄糖骨架H，Ph-CH2)，2.36～1.90(6H，Ph-CH3)；IR(KBr，cm-1)υ：3 389～3 318(-NH-)；3 059，2 924，2 863(-C-H)；1 714，1 661，1 528，1 451，1 406(-OCONH-，-CONH-)；1 602(-Ph)，1 055(C-O-C)。

按以上制備方法，用4-氯苯基異氰酸酯修飾殼聚糖芐基脲，得到殼聚糖-3,6-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-2-(芐基脲)，即CS2，產(chǎn)率為72%。

1H NMR(600 MHz，DMSO-d6，90 ℃，δ/ppm)：9.61～8.92(2H，Ph-NH-CO2)，7.72～6.68(13H，Ph-H)，6.40～5.49(2H，-NH-CO-NH-)，5.17～3.21(9H，氨基葡萄糖骨架H，Ph-CH2)；IR(KBr，cm-1)υ：3 397～3 326(-NH-)；3 112，3 061，2 936，2 877(-C-H)；1 720，1 661，1 534，1 497(-OCONH-，-CONH-)；1 604(-Ph)；1 059(C-O-C)。

1.3 手性固定相的制備和填裝

參照文獻(xiàn)中的方法制備氨丙基硅膠[15]。將0.65 g的CS1溶解在30 mL DMF中，得到CS1溶液。取10 mL此溶液，向其中加入2.60 g 3-氨基丙基硅膠，超聲，使其混合均勻，在減壓及45～50 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀緩慢均勻地蒸出DMF。每次使用10 mL CS1溶液，重復(fù)兩次上述涂敷過程。最后將固體真空干燥至恒重，得到白色細(xì)粉末，即為CSP1。按上述涂敷方法，制得CSP2。在涂敷中，CS1和CS2的投料量均為20%。用20 mL正己烷/異丙醇(90/10，V/V)將約為3.0 g CSP1或CSP2制備成勻漿液，用正己烷為頂替液，在約為34.5 MPa壓力下，將勻漿液壓入空的色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.)內(nèi)，制得填充有CSP1或CSP2的手性色譜柱。

1.4 分離性能的評價

在本文的所有檢測中，柱溫箱的溫度均設(shè)置為25 ℃，流動相的流速均為1 mL/min。以正己烷/異丙醇(90/10,V/V)為流動相，聯(lián)苯和1，3，5-三(叔丁基)苯為分析物，測定手性色譜柱的柱效和死時間(t0)。以如圖1所示手性化合物為分析物，在正己烷/異丙醇(90/10,V/V)、正己烷/乙醇(90/10,V/V)和正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,V/V)三種流動相條件下，測試CSP1和CSP2的分離性能。

色譜參數(shù)為：容量因子k=(t-t0)/t0，其中t為手性分析物中的某一對映體或手性分析物(如果沒有被手性識別)的保留時間；分配因子α=k2/k1，k1和k2分別為兩個對映體的容量因子，當(dāng)α>1.0時，即發(fā)生了手性識別；分離度RS=2(t2-t1)/(w1+w2)，t1和t2分別為第一及第二個被洗脫出來的對映體的保留時間，w1和w2分別為這兩個對映體色譜峰的峰寬，當(dāng)RS≥1.50時，兩個對映體達(dá)到了基線分離。

圖1 手性分析物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of chiral analytes

2 結(jié)果與討論

2.1 CSP1和CSP2的手性分離性能

CSP1和CSP2在三種流動相條件下的分離結(jié)果如表1所示。從表1可知，CSP1和CSP2分別識別了14和15種手性分析物的對映體，都基線分離了其中的8種?？偟膩碚f，這兩種CSP的手性分離性能沒有非常大的差別。在CS1和CS2的分子中，CS1的苯環(huán)對位上為甲基，而CS2的苯環(huán)對位上為氯，它們的結(jié)構(gòu)相似，但又不完全相同，所以，CS1和CS2的高級結(jié)構(gòu)也應(yīng)該相似，導(dǎo)致其手性分離性能大抵相當(dāng)。而CS1和CS2高級結(jié)構(gòu)細(xì)微的不同又造成CSP1和CSP2在對映體分離特征上仍稍有差別。如有7個手性樣品在CSP1和CSP2上均得到了基線分離，其中5個手性樣品在CSP1上的分離度比在CSP2上的大；雖然3、5、14號這三個樣品在CSP1和CSP2上僅被識別，而5號和14號樣品在CSP1上仍有更大的分離度。以上結(jié)果表明，CS1和CS2的苯環(huán)上連接不同的取代基對固定相的對映體分離有一定的影響。

表1 CSP1和CSP2的手性分離結(jié)果Table 1 Enantioseparation results of CSP1 and CSP2

(續(xù)表1)

2.2 手性選擇體結(jié)構(gòu)對手性分離的影響

對于多糖苯基氨基甲酸酯衍生物來說，極性官能團(tuán)氨基甲酸酯是發(fā)生手性識別最重要的部位，因?yàn)樵摴倌軋F(tuán)與手性樣品的對映體能發(fā)生氫鍵及偶極-偶極相互作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在苯環(huán)上設(shè)置給電子或吸電子基會影響多糖苯基氨基甲酸酯衍生物的手性分離[16]。譬如，CS2的苯環(huán)上連有吸電子基團(tuán)氯，通過與苯環(huán)的共軛作用，該氯原子能分散氨基甲酸酯中N上的電子云密度，使-NH-C=O中H的酸性增強(qiáng)，繼而使CS2與手性樣品之間的氫鍵作用也隨之增強(qiáng)，大多數(shù)手性樣品在CSP2上有更大的容量因子就驗(yàn)證了這一推論。此外，對于多糖衍生物類的CSP，手性分離還受手性選擇體高級結(jié)構(gòu)的影響，而多糖衍生物中的取代基又影響手性選擇體的高級結(jié)構(gòu)。從圖2A可以看出，在正己烷/乙醇(90/10，V/V)中，9號分析物在CSP1上的分離度更大，其原因可能是，與CS2相比，9號樣品的一個對映體容易嵌入CS1的螺旋空腔中，使兩個對映體有更大的分離度，而CS1螺旋空腔的形狀和大小應(yīng)與苯環(huán)上的甲基相關(guān)；從圖2B可知，在正己烷/乙醇(90/10，V/V)中，CSP2能夠基線分離16號樣品，而CSP1則不能識別該樣品對映體。除了氫鍵作用外，相信CS2螺旋空腔的形狀和大小和16號樣品得到基線分離也有關(guān)，CS2的高級結(jié)構(gòu)又受到苯環(huán)上氯原子的支配。

本文還觀察到一些有趣的分離結(jié)果：含有脲基結(jié)構(gòu)的1號和15號樣品，以及含有鹵素原子的5、6和11號樣品在CSP1上的分離度均大于在CSP2上的分離度，說明苯環(huán)上連接著甲基的CS1更利于含脲基或含鹵素手性樣品的分離；而含有酰胺官能團(tuán)的2、3、和8號樣品在CSP2上具有更大的分離度。

圖2 9號和16號手性樣品在CSP 1、CSP 2上的分離色譜圖。流動相：正己烷/乙醇(90/10,V/V)Fig.2 Chromatograms of chiral analytes 9 and 16 separated by CSP 1 and CSP 2.Mobile phase:n -hexane/ethanol(90/10,V/V)

3 結(jié)論

本文將殼聚糖2位上的氨基選擇性地轉(zhuǎn)換為芐基脲，再用4-甲基苯基異氰酸酯和4-氯苯基異氰酸酯修飾殼聚糖芐基脲上的羥基，制得CS1和CS2，并以此制備了相應(yīng)的CSP。所制得的兩種CSP均具有較好的手性識別能力，比較手性樣品在這兩種CSP上的分離度發(fā)現(xiàn)，含甲基的CSP稍比含氯的CSP有更好的手性分離性能。另外，大多數(shù)手性樣品在含氯原子的CSP上有更大的容量因子。手性樣品在兩種CSP上有不同的容量因子和不同的分離度與CS1和CS2上所連接的甲基及氯原子有關(guān)。