房 寬，徐 茜，林 卿，林 偉，張曉蓮，劉亞磊，王秀國，宋江雨，劉建陽，劉 通

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所，山東 青島 2661002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081；3.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000)

煙草作為一種重要的經(jīng)濟作物，具有多種種植方式，其中稻煙輪作是較為廣泛的模式之一。大田生產(chǎn)過程中，多種方法被用于煙草病蟲草害防治，其中，化學(xué)防治備受農(nóng)民歡迎，除草劑銷量也一直較高，但是，現(xiàn)今除草劑市場魚龍混雜，且所需應(yīng)用技術(shù)高，稍有不慎就會出現(xiàn)藥害。目前已知的除草劑品種達(dá)幾十種，主要有激素類的二氯喹啉酸，雜環(huán)類的滅草松、酰胺類的異丙甲草胺等，這些除草劑大都具有用量少、適用范圍廣等優(yōu)點[1]，但隨著施藥量的增大和不規(guī)范使用，除草劑對作物也產(chǎn)生了藥害作用，主要包括廣泛殘留性、技術(shù)性、飄移性[2]3種藥害，由于防治知識和手段的匱乏，且防治不積極，導(dǎo)致煙株受害加重、煙葉產(chǎn)量降低，對輪作作物也會產(chǎn)生不良影響。雙草醚是一種典型的嘧啶苯甲酸類除草劑，使用后會快速被植物吸收，藥效發(fā)揮迅速，且用藥量較少，具有廣譜性，可有效防治稻煙輪作系統(tǒng)中的多種雜草[3]，由于藥效極佳，雙草醚近年來被廣泛使用，但由于雙草醚本身的性質(zhì)、天氣原因以或不當(dāng)使用，藥害頻繁發(fā)生，導(dǎo)致煙草經(jīng)濟收入降低，民事糾紛時常發(fā)生[4]。

目前，國內(nèi)對于雙草醚的研究大多停留在防效試驗以及科學(xué)使用方面，如余錚等[5]、嵇方針等[6]研究了多種除草劑在水稻上的藥效試驗；彭凱靈等[7]研究了雙草醚對直播稻田中雜草的防治效果；賈忠建等[8]研究了雙草醚的科學(xué)正確使用方法，郭之杰[9]、肖慰祖等[10]研究了助劑對雙草醚藥效的影響。但以往研究沒有對除草劑殘留產(chǎn)生的藥害癥狀、生理性狀變化進行系統(tǒng)探究，無法計算出致害劑量，不能對田間施藥安全間隔期進行合理評估。鑒于此，通過大田試驗和室內(nèi)盆栽試驗，主要采用藥害癥狀識別試驗、生理性狀變化試驗、殘留消解試驗等方法識別煙株的藥害癥狀，探究煙株農(nóng)藝性狀和體內(nèi)激素含量變化，分析雙草醚的殘留消解規(guī)律，評估田間施藥安全間隔期，以期促進雙草醚在稻煙輪作區(qū)的科學(xué)正確使用，減輕藥害發(fā)生程度，推動煙草安全生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗地點及供試材料

試驗于2017年在福建煙草公司南平市公司南平市煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地進行。10%雙草醚可分散油懸浮劑由陜西上格之路生物科學(xué)有限公司提供，雙草醚標(biāo)準(zhǔn)品(98.5%)由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供；供試煙草品種為NC89。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 雙草醚田間藥害試驗 10%雙草醚可分散油懸浮劑推薦劑量為300 mL/hm2，設(shè)計推薦劑量的1/4、2、5、10倍4個不同的施藥劑量，施藥方法：4個施藥劑量均對水3 000 mL稀釋，對煙株根部均勻噴施，噴施時間為煙株團棵期和旺長期。每個施藥劑量3個重復(fù)，每個重復(fù)為10株生長狀況相對一致的煙株，各施藥劑量處理之間相隔2個未經(jīng)藥劑處理的煙株，插牌做好標(biāo)記。定期使用相機拍照，記錄煙株受害情況。

1.2.2 雙草醚盆栽煙草藥害試驗 分別設(shè)計10%雙草醚可分散油懸浮劑推薦劑量的0(CK)、1/8、1/4、1/2、1、2、5倍7個不同施藥劑量對土壤進行處理，其中CK采用清水處理。施藥方法：根據(jù)不同施藥劑量對水500 mL稀釋，采用噴霧法分別施加到10 kg土壤中，使土壤含水量達(dá)到土壤最大持水量的60%。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，將處理好的土壤置于直?2 cm、高25.5 cm的塑料花盆內(nèi)，每個劑量5個重復(fù)。將花盆置于大棚內(nèi)，將試驗煙草移入花盆中，溫濕度、水肥操作均按正常農(nóng)事操作進行。定期使用相機拍照，記錄煙株受害情況。

1.2.3 雙草醚殘留降解試驗

1.2.3.1 盆栽土壤和煙草中的殘留降解 上述盆栽樣品于施藥后1 h，1、3、5、10、15、20、30、40、50、60 d采集土壤樣品和煙葉樣品。采集土壤樣品時，將同一劑量處理土壤樣品混勻后過孔徑2 mm篩，然后利用四分法留取土壤樣品200 g；采集鮮煙葉樣品時，將同一劑量處理的鮮煙葉樣品混合，切碎混勻，然后利用四分法留取樣品50 g。采集樣品后立即置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3.2 田間土壤中殘留降解 由于田間經(jīng)常出現(xiàn)農(nóng)民大劑量多次用藥，故采用10%雙草醚可分散油懸浮劑10倍推薦劑量作為施藥劑量，即3 000 mL/hm2，累計施藥3次，每次施藥間隔10 d。利用土鉆在處理后1 h，1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80 d分別鉆取試驗地0～10 cm土層土壤樣品。采用“S”形取樣方法進行多點取樣，每次取樣不得少于1 000 g，將土樣過孔徑2 mm篩，然后采用四分法留樣300 g，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。同時，采集空白對照(CK)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 雙草醚殘留量 采用液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)測定，液相色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18，色譜柱為2.1 mm×100 mm，3.0 μm，柱溫為25 ℃，流速為0.25 mL/min，進樣量為10 L。定性、定量離子分別為239.9/35.2(m/z)、239.9/196.0(m/z)。提取以及凈化方法參照劉修園[11]的方法進行。

1.3.2 煙草農(nóng)藝性狀 盆栽試驗于施藥后第30、40、50、60天觀察煙草的農(nóng)藝性狀差異，并利用標(biāo)準(zhǔn)卷尺測量煙株的株高、最大葉片的長和寬，計算煙株葉面積。抑制率公式如下：

株高抑制率=(對照平均株高-處理平均株高)/對照平均株高×100%，

葉面積抑制率=(對照平均葉面積-處理平均葉面積)/對照平均葉面積×100%[12]。

1.3.3 煙草激素含量 在步驟1.2.3.2中，分別于10%雙草醚可分散油懸浮劑10倍推薦劑量施藥后，于團棵中后期(移栽后30 d)，隨機采集大田煙株藥害明顯的心葉部位樣品以及中上部位葉片樣品，分類保存后，分別取10 g樣品，依據(jù)易勇等[13]的方法提取赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)3種內(nèi)源激素并用UPLC-MS/MS測定含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

大田消解試驗中，雙草醚在土壤中的降解半衰期計算公式：

Ct=C0e-kt，

T1/2=ln2/k

式中，Ct為t時刻土壤中雙草醚的含量(mg/kg)，C0為雙草醚初始含量(mg/kg)，k為反應(yīng)速率常數(shù)(d-1)，T1/2為雙草醚在土壤中的降解半衰期(d)。

致害臨界值：葉面積抑制率以及株高抑制率為10%～15%時的施藥劑量，以株高抑制率為主要參考標(biāo)準(zhǔn)[14]。

施藥安全間隔期：將土壤中除草劑致害臨界含量數(shù)值代入除草劑大田消解動態(tài)方程，即可對施藥安全間隔期進行評估[11]。

利用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙草醚的藥害識別

2.1.1 田間煙草藥害識別 不同劑量雙草醚藥劑處理15 d后，其在煙草上的藥害癥狀隨施藥劑量升高而加重。10%雙草醚可分散油懸浮劑1/4倍推薦劑量處理組沒有明顯藥害產(chǎn)生，2倍推薦劑量處理組產(chǎn)生輕微藥害，5倍和10倍推薦劑量處理組藥害癥狀最為明顯。圖1為10倍推薦劑量處理后，煙株在團棵期(圖1A、B、C)和旺長期(圖1D、E、F)的藥害癥狀。團棵期藥害癥狀為煙葉變黃且出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，煙株中部與底部葉片產(chǎn)生褐色藥斑，煙株矮化，節(jié)間距離變短；旺長期藥害癥狀為煙株整體黃化，底部葉片有褐色藥斑且枯萎壞死，葉片中部葉脈有褐色藥斑，煙株矮化嚴(yán)重，節(jié)間距離變短。

A、B、C:團棵期; D、E、F:旺長期

2.1.2 盆栽煙草藥害識別 如圖2所示，藥劑處理40 d后，10%雙草醚可分散油懸浮劑1/8、1/4、1/2倍推薦劑量對煙株影響較?。?、5倍劑量產(chǎn)生藥害癥狀較為明顯，嚴(yán)重影響煙株的生長發(fā)育，主要表現(xiàn)為煙株矮化較為明顯，葉片有明顯變黃的趨勢，產(chǎn)生嚴(yán)重藥害后煙株難以恢復(fù)。

CK: 0倍推薦劑量; Ⅰ—Ⅵ:分別表示1/8、1/4、1/2、1、2、5倍推薦劑量

2.2 雙草醚致害煙草的農(nóng)藝性狀和生理性狀變化

2.2.1 農(nóng)藝性狀 如表1所示，雙草醚處理后，除空白對照外，不同劑量處理對煙草株高和葉面積均有影響，其中1/8、1/4倍推薦劑量處理組對煙株農(nóng)藝性狀的影響較小，但隨施藥劑量增加和藥后時間增長，煙株農(nóng)藝性狀受到的影響逐漸增強，其中，對于葉面積抑制率最高達(dá)90.6%，對株高的抑制率最高達(dá)77.9%。在藥后60 d，雙草醚對煙草葉面積和株高的抑制作用效果大致相同，5倍推薦劑量處理對煙草株高和葉面積的抑制率均大于60%。

表1 10%雙草醚可分散油懸浮劑推薦劑量不同施藥倍數(shù)處理的盆栽煙株農(nóng)藝性狀變化

2.2.2 激素含量 在多種內(nèi)源激素中，IAA、GA3、ABA對煙草生長起著舉足輕重的作用，其中，GA3具有促進作物生長發(fā)育，促進發(fā)芽、分蘗、抽薹的作用；IAA的作用在于調(diào)節(jié)植物的生長，促進生長發(fā)育；ABA對植株生長發(fā)育起抑制作用，促進植物衰老，引起氣孔關(guān)閉，植物處于逆境時會大量分泌此激素。植物生長發(fā)育旺盛時，IAA、GA3含量較高，ABA含量較低，處于逆境時則相反[15]。因此，可以根據(jù)煙株體內(nèi)這3種激素的變化，從微觀角度觀察外界因素致使煙株產(chǎn)生的不良癥狀。

由圖3可見，10%雙草醚可分散油懸浮劑10倍推薦劑量處理后，受害煙株心葉與中上部葉片內(nèi)激素含量發(fā)生不同程度變化。其中，與CK相比，雙草醚處理后中上部葉片中IAA、GA3含量分別顯著降低42.2%、74.6%(P<0.05)，ABA含量顯著增加47.7%(P<0.05)。雙草醚處理后心葉中IAA、GA3含量分別較CK顯著降低23.6%、33.4%(P<0.05)，而ABA含量與CK沒有顯著變化(P≥0.05)。由此可以看出，10%雙草醚可分散油懸浮劑10倍推薦劑量處理后，受害煙株的細(xì)胞分裂、生長發(fā)育功能受損，煙株開始進行程序性凋亡來應(yīng)對雙草醚藥害脅迫，這與藥害識別試驗中植株矮小、節(jié)距變短、葉片壞死等不良癥狀相互印證。

不同字母表示不同處理相同激素差異顯著(P<0.05)

2.3 雙草醚殘留消解動態(tài)

2.3.1 雙草醚在盆栽土壤中的殘留動態(tài) 如圖4可見，盆栽試驗中，10%雙草醚可分散油懸浮劑推薦劑量的1/8、1/4、1/2、1、2、5倍處理土壤中雙草醚原始沉積量分別為 0.004、0.007、0.013、0.026、0.059、0.149 mg/kg；施藥15 d 后，雙草醚在各處理組盆栽土壤中的降解均達(dá)到1/2以上。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能是在藥劑處理后0～15 d，煙株受害程度較小，煙株生命力旺盛，新陳代謝較快，因此,土壤中雙草醚殘留量下降較快；藥劑處理后15～60 d，煙株受害程度加深，煙株各種生命活動減緩，土壤中雙草醚降解速率降低。

圖4 10%雙草醚可分散油懸浮劑在盆栽土壤中的殘留動態(tài)

2.3.2 雙草醚在盆栽煙葉中的殘留動態(tài) 盆栽試驗中，不同劑量雙草醚處理藥后30、40、50、60 d煙葉中的雙草醚殘留結(jié)果如表2所示，10%雙草醚可分散油懸浮劑 1/8、1/4 倍推薦劑量處理均未檢測雙草醚殘留；10%雙草醚可分散油懸浮劑 1/2、1、2、5倍推薦劑量處理在藥后30 d之后，隨時間延長，雙草醚殘留量呈降低趨勢，藥后60 d最終殘留量分別為0.001 6、0.002 4、0.007 6、0.082 0 mg/kg。

表2 10%雙草醚可分散油懸浮劑在盆栽煙葉中的雙草醚殘留

2.3.3 雙草醚在田間土壤中的消解動態(tài) 由圖5可見，10%雙草醚可分散油懸浮劑10倍推薦劑量處理土壤中雙草醚的原始沉積量為0.586 mg/kg，施藥10 d后，雙草醚在土壤中降解率超過50%，施藥80 d后，雙草醚最終殘留量為0.014 mg/kg。由一級動力學(xué)方程可得，雙草醚在大田土壤中的理論半衰期為15.4 d。

圖5 雙草醚在田間土壤中的殘留動態(tài)

2.3.4 雙草醚產(chǎn)生藥害的劑量及安全間隔期 根據(jù)雙草醚在盆栽煙草和田間煙草產(chǎn)生藥害的時間和癥狀，結(jié)合在盆栽、大田中的殘留狀況，計算出產(chǎn)生藥害的臨界劑量，代入消解動態(tài)方程，可對雙草醚大田安全間隔期進行評估。

在盆栽煙株農(nóng)藝性狀變化試驗中，以150 mL/hm2的10%雙草醚可分散油懸浮劑處理40 d后，煙株葉面積抑制率以及株高抑制率在10%～15%，因此，150 mL/hm2可作為10%雙草醚可分散油懸浮劑致煙草藥害的臨界藥劑用量，此時在盆栽土壤和煙草葉片中，雙草醚含量分別為 0.012 0、0.018 5 mg/kg；據(jù)雙草醚大田消解動態(tài)試驗，雙草醚在田間土壤中的消解動態(tài)方程為y=0.467 3e-0.046x，將產(chǎn)生藥害時土壤中雙草醚含量(即y=0.012 0 mg/kg)代入田間消解動態(tài)方程，得到雙草醚在大田中的施藥安全間隔期(x)為85 d。

3 結(jié)論與討論

煙草在我國國民經(jīng)濟中具有相當(dāng)重要的作用。近年來，煙草質(zhì)量安全問題已成為研究熱點，其中農(nóng)藥殘留問題是影響煙草經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的重要因素。由于自然氣候以及土壤理化性質(zhì)的影響，不同劑量除草劑的降解速率會產(chǎn)生差異，繼而引起不同的藥害癥狀，因此，明確除草劑藥害癥狀的差異，并與其在土壤和植株中的殘留量變化相結(jié)合，有助于除草劑藥害癥狀的快速識別，繼而制定相應(yīng)的對策，符合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實際。從本研究結(jié)果來看，10%雙草醚可分散油懸浮劑1/4倍推薦劑量下無明顯藥害產(chǎn)生，但隨著施藥劑量的升高，煙草藥害癥狀愈發(fā)明顯，5、10倍推薦劑量處理甚至出現(xiàn)枯萎壞死癥狀，這與楊森等[16]研究除草劑土壤殘留導(dǎo)致煙草藥害的結(jié)果一致。

株高、葉面積等農(nóng)藝性狀對煙草質(zhì)量和產(chǎn)量有著重要影響，探究雙草醚對煙草農(nóng)藝性狀的影響，結(jié)合煙草藥害癥狀以及激素含量變化，可掌握不同劑量雙草醚對煙草產(chǎn)生的影響，對田間施藥具有較高的借鑒意義。植物激素是一類植物自身體內(nèi)分泌痕量化合物[17]，植物內(nèi)源激素在代謝、生長和形態(tài)建成等植物生理活動各方面均起著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。明確煙草激素含量變化，并結(jié)合農(nóng)藝性狀的變化，有助于分析除草劑藥害產(chǎn)生的原因。在激素水平，雙草醚藥害導(dǎo)致煙株激素含量紊亂，抑制煙草IAA、GA3合成，導(dǎo)致煙株葉片細(xì)胞無法正常分裂、伸長，進而引起植株矮化，葉面積變?。煌瑫r引起ABA含量增高，導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉和新陳代謝受阻，進而影響植物生長發(fā)育。在農(nóng)藝性狀水平上，雙草醚藥害抑制葉面積和株高的正常生長，導(dǎo)致植株瘦小，生長畸形，在施藥處理末期，高劑量雙草醚處理對煙草株高和葉面積的抑制率均高于60%，這與于慶濤等[19]研究除草劑對煙株生長發(fā)育的影響結(jié)果基本一致。

雙草醚施用劑量與藥害存在著時間-劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨藥后時間的延長和施藥劑量的增大，雙草醚殘留對煙株生理性狀的影響越大，藥害癥狀越明顯。根據(jù)雙草醚殘留消解動態(tài)試驗可得，雙草醚理論半衰期 15.4 d，大田土壤中的最終殘留量為0.014 mg/kg，施藥劑量越高，殘留量越高，降解半衰期越長。

本研究結(jié)果表明，10%雙草醚可分散油懸浮劑致煙草藥害的臨界施藥劑量為150 mL/hm2，此時，在大田土壤和葉片中的雙草醚含量分別為0.012 0、0.018 5 mg/kg，安全間隔期為85 d。因此，在稻煙輪作區(qū)，若土壤中雙草醚含量超過0.012 0 mg/kg，建議先采取措施降解農(nóng)藥殘留再種植煙草；若在生長的煙草中檢測到雙草醚含量超過0.018 5 mg/kg，應(yīng)該及時采取措施，防止藥害進一步擴大；每次施藥間隔不得少于85 d。