李國明，祖慶學(xué)，馮裕祥，廖 恒，張 涵，陸引罡,4

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 花溪 550025；2.貴陽市煙草公司開陽縣分公司，貴州 開陽 550300；3.貴州省土壤肥料研究所，貴州 花溪 550025；4.貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

鎂(Mg)和錳(Mn)是烤煙正常生長必需的營養(yǎng)元素。鎂是葉綠素組分中的唯一金屬元素，錳通過影響葉綠體膜的合成進而影響葉綠素的合成，二者是多種酶的輔助因子，可以激活酶的活性，促進植物體內(nèi)多種酶促反應(yīng)的進行，對煙草生理代謝及品質(zhì)形成均有重要作用[1-6]。一方面，鎂、錳通過活化酶，影響烤煙萜類化合物的合成。萜類化合物是煙草的重要化學(xué)成分之一，不僅對煙草的生長發(fā)育具有重要的生理意義，而且對煙草品質(zhì)的形成尤其是香氣的產(chǎn)生具有重要作用[7]。二萜類物質(zhì)是其中一種極為重要的香氣前提物質(zhì)，而西柏烷類化合物是烤煙二萜類物質(zhì)的重要組成成分，在一定程度上影響烤煙的香氣質(zhì)量和煙氣特征[8-12]。異戊烯焦磷酸(IPP)是合成萜類化合物的直接前提物質(zhì)，IPP的合成通過2個途徑進行，即位于細胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑[13]和位于質(zhì)體中的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑[14]或甲基赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑[15]。MVA途徑主要合成植物細胞質(zhì)中的倍半萜、三萜及多萜，DXP/MEP途徑主要合成植物質(zhì)體中的單萜、二萜和四萜[16-18]?？緹熗ㄟ^DXP途徑形成IPP，IPP進一步衍化形成萜類物質(zhì)，進而影響香氣質(zhì)量。另一方面，鎂、錳通過影響葉綠素的合成以及對多種酶的活化作用對三羧酸循環(huán)產(chǎn)生影響，進而影響煙草有機酸及高級脂肪酸的含量。煙草中的有機酸對煙草生長過程中的生理代謝起著重要作用[19]。有機酸與生物堿反應(yīng)生成鹽類物質(zhì)，或以脂類的形態(tài)存在于煙葉中，通過調(diào)節(jié)化合態(tài)和游離態(tài)2種類型煙堿的比例，影響烤煙生物量，進一步影響烤煙的吸味、勁頭及刺激性[20-21]。高級脂肪酸通過酶或非酶作用降解轉(zhuǎn)化成低分子的致香成分[20,22]，不飽和脂肪酸能夠增加卷煙的豐滿度和粗糙感[23]，是衡量烤煙品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。陳思昂等[24]研究認(rèn)為，不同部位煙葉揮發(fā)性有機酸含量均對烤后煙葉pH值、香氣、刺激性具有顯著影響。

目前，不同海拔、溫度、光照、品種等對烤煙香氣質(zhì)量的影響較多，關(guān)于烤煙鎂、錳肥的研究主要集中在對烤煙產(chǎn)量的影響方面，對香氣質(zhì)量的影響研究鮮有報道。鑒于此，以貴州煙區(qū)主栽品種云煙87為研究對象，研究了鎂、錳不同施用量條件下烤煙DXP途徑中關(guān)鍵物質(zhì)及部分有機酸、高級脂肪酸含量的變化，為貴州煙區(qū)主栽品種云煙87煙葉品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地點和供試材料

試驗于2019年4—9月在貴州大學(xué)南校區(qū)盆栽場進行，供試烤煙品種為云煙87，由貴州省開陽縣煙草公司提供。硫酸鎂(MgSO4·7H2SO4)、硫酸錳(MnSO4)均為分析純，由成都金山化學(xué)試劑有限公司提供。供試肥料為貴陽市現(xiàn)行施用的烤煙專用基肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=9∶10∶27]和煙草專用追肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=13∶0∶26]，由湖北香青化肥有限公司提供。供試土壤取自貴州大學(xué)西校區(qū)農(nóng)學(xué)院后山(106°39′35″E，26°26′54″N)，主要理化性質(zhì)為全氮1.39 g/kg，堿解氮54.41 mg/kg，有效磷23.56 mg/kg，速效鉀124.37 mg/kg，有機質(zhì)15.22 g/kg，pH值6.54。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置5個處理，分別記作CK(硫酸鎂=0 g/株，硫酸錳=0 g/株)、T1(硫酸鎂=10 g/株)、K1(硫酸錳=10 g/株)、T2(硫酸鎂=20 g/株)、K2(硫酸錳=20 g/株)。試驗常規(guī)氮肥基追肥比為7∶3，盆栽試驗施肥量為大田施肥量的3倍，基肥和追肥用量分別為136.6 g/株和41.0 g/株；根據(jù)CK、T1、T2、K1、K2，將不同施用量硫酸鎂、硫酸錳與基肥和土壤一起充分混勻裝盆，每盆20 kg。試驗采取隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次，每個處理3盆，每盆植煙1株，共計45盆。4月20日，選取健壯、整齊的煙苗進行移栽，各處理均采用相同的施肥手段和烤煙管理標(biāo)準(zhǔn)，并于烤煙移栽后35 d統(tǒng)一施入煙草專用追肥。

1.3 樣品采集與測定分析

1.3.1 烤煙DXP途徑中間產(chǎn)物含量的測定 DXP途徑中間產(chǎn)物(主要包括丙酮酸、DXP、IPP)含量采用GC-MS進行測定。取各處理成熟期中部葉片(從下往上數(shù)第9片)，所取樣品經(jīng)105 ℃殺青0.5 h，65 ℃烘干，經(jīng)磨碎后過1 mm篩，裝袋編號后備用，稱取3.000 0 g粉末樣品于50 mL離心管中，加入15 mL二氯甲烷，渦旋1 min，混勻，超聲提取20 min，重復(fù)提取2次，將所得提取液過無水硫酸鈉層于100 mL圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用二氯甲烷定容至5 mL，過濾膜，上機分析。利用Shimadzu GCMS-QP2020 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。由于送樣檢測時，測試公司未能買到對應(yīng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)藥品，故以峰面積的形式表示含量。

1.3.2 烤煙西柏烯二萜醇含量的測定 分別于團棵期、旺長期、成熟期選定煙株的功能葉片(從下往上數(shù)第9片)，樣品經(jīng)105 ℃殺青0.5 h，65 ℃烘干，經(jīng)研磨后過1 mm篩，裝入自封袋編號備用。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g煙末，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL提取溶液(0.005 g/mL正十七烷醇-二氯甲烷溶液)，超聲振蕩10 min后，用裝有5 g無水硫酸鈉的濾紙濾去煙末。取10 mL濾液至濃縮瓶中，在500 mba、40 ℃條件下濃縮去除溶劑。加入500 μL N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)和500 μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，洗滌濃縮瓶內(nèi)壁，將所得溶液轉(zhuǎn)入色譜瓶。在75 ℃水浴中進行衍生化反應(yīng)60 min，得到GC/MS分析樣品溶液[25]。利用Shimadzu GCMS-QP2020氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.3.3 烤煙部分有機酸及高級脂肪酸含量的測定 采用H2SO4-CH3OH溶液衍生化反應(yīng)進行樣品處理，用氣相色譜儀進行測定[26]。稱取0.500 g煙末于干燥三角瓶中，加入25 mL 7% H2SO4-CH3OH溶液，準(zhǔn)確抽取100 μL內(nèi)標(biāo)溶液(0.05 g/mL己二酸-甲醇溶液)，搖勻，室溫放置20 h進行甲酯化反應(yīng),用濾紙過濾到盛有50 mL蒸餾水的分液漏斗中，二氯甲烷萃取(100 mL×3)，萃取液加無水硫酸鈉干燥后，直接取1.0 μL進樣分析。有機酸和脂肪酸標(biāo)樣采用完全相同的處理過程，以制備內(nèi)標(biāo)法校正工作曲線并對各酸進行保留時間對照法定性。采用GC-14B氣相色譜儀分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2016、Origin 2018和DPS 7.05進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎂、錳對烤煙DXP途徑中間物質(zhì)含量的影響

2.1.1 丙酮酸 圖1a顯示，施用鎂、錳后，成熟期煙葉丙酮酸含量較CK顯著增加。T1、K1、T2、K2較CK分別提高9.14%、10.72%、16.65%、14.59%，以T2處理煙葉丙酮酸含量最高?？赡苁且驗楸嶂饕商墙徒猱a(chǎn)生，鎂、錳作為糖酵解中磷酸果糖激酶的催化物，可以促進糖酵解的進行，進而增加丙酮酸的含量。

2.1.2 DXP 圖1b顯示，施用鎂、錳后，成熟期煙葉DXP含量較CK顯著增加。T1、K1、T2、K2較CK分別提高8.44%、5.87%、22.78%、21.44%，以T2處理煙葉DXP含量最高，相同施用水平條件下，鎂對烤煙葉片DXP含量的增加效果較錳更明顯。一方面可能與鎂、錳作為1-脫氧-5-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)的催化劑相關(guān)，另一方面可能與丙酮酸含量增加有關(guān)。

2.1.3 IPP 圖1c顯示，施用鎂、錳后，成熟期煙葉IPP含量較CK顯著增加。T1、K1、T2、K2較CK分別提高13.29%、17.13%、33.68%、25.52%，以T2處理煙葉IPP含量最高?？赡芘c鎂、錳促進相關(guān)反應(yīng)酶活性及上游物質(zhì)含量增加有關(guān)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 鎂、錳對烤煙西柏三烯二醇含量的影響

2.2.1 α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇 圖2a表明，烤煙α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量隨生育時期的推進呈先增加后降低的趨勢，整體表現(xiàn)為旺長期>成熟期>團棵期。與CK相比，施用鎂、錳離子可以顯著提高烤煙葉片α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇的含量，且在一定范圍內(nèi)隨施用量的增加而增加。在施用量20 g/株條件下，旺長期施鎂的煙株α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量顯著高于施錳的煙株，其余同水平施用條件下，分施鎂、錳對烤煙α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量的影響無顯著差異。團棵期，T1、K1、T2、K2處理α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量分別較CK提高12.8%、15.14%、31.48%、33.37%；旺長期分別較CK提高8.56%、6.31%、26.46%、17.13%；成熟期分別提高6.22%、5.19%、11.99%、10.06%。

2.2.2 β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇 圖2b表明，烤煙β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量與α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量的變化規(guī)律相似，團棵期，T1、K1、T2、K2處理β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量分別較CK提高25.54%、26.14%、46.79%、52.24%；旺長期分別提高10.4%、8.68%、39.57%、35.62%；成熟期分別提高27.61%、25.76%、36.72%、34.71%。

圖2 鎂、錳對烤煙α-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇(a)、β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇(b)含量的影響

綜上，施用鎂、錳均能有效提高烤煙西柏三烯二醇的分泌和積累，施鎂處理效果更佳。

2.3 DXP途徑中間物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

由表1可知，對鎂、錳不同施用量條件下烤煙DXP途徑各項產(chǎn)物含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，烤煙DXP途徑各級反應(yīng)產(chǎn)物含量正相關(guān)。施鎂條件下，丙酮酸、IPP含量與α-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇含量，DXP含量與IPP含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；施錳條件下，丙酮酸含量與IPP、β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇含量，IPP含量與β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。DXP途徑自上而下，由丙酮酸到DXP、IPP再到2種西柏三烯二醇，含量均隨鎂、錳施用量的增加而增加。綜上，施用鎂、錳可以促進烤煙DXP反應(yīng)途徑的進行，對烤煙主要香氣物質(zhì)的產(chǎn)生起到調(diào)控作用。

表1 施用鎂、錳后烤煙DXP途徑中間物質(zhì)含量相關(guān)性分析

2.4 鎂、錳對烤煙部分有機酸含量的影響

2.4.1 蘋果酸 圖3a顯示，烤煙蘋果酸含量隨生育期的推進呈增加趨勢。與CK相比，施用鎂、錳總體上顯著提高蘋果酸的積累量，在一定范圍內(nèi)隨施用量增加而增加，且同水平施用條件下，分施鎂、錳效果差異不顯著。團棵期，T1、K1、T2、K2處理烤煙蘋果酸含量分別較CK提高4.89%、3.83%、14.91%、17.79%，旺長期分別提高6.13%、5.53%、17.95%、16.52%，成熟期分別提高6.99%、6.03%、21.77%、17.20%。

2.4.2 檸檬酸 圖3b顯示，烤煙檸檬酸含量隨生育期的推進呈先減后增的趨勢。與CK相比，施用鎂、錳總體上顯著提高檸檬酸的積累量，在一定范圍內(nèi)隨施用量增加而增加。在20 g/株施用水平下，施錳效果更好。團棵期，T1、K1、T2、K2處理烤煙檸檬酸含量分別較CK提高5.31%、7.28%、18.83%、20.92%；旺長期分別提高13.30%、16.64%、34.94%、46.42%；成熟期分別提高9.20%、13.40%、19.71%、35.48%。

圖3 鎂、錳對烤煙蘋果酸(a)和檸檬酸(b)含量的影響

綜上，鎂、錳處理均有利于烤煙蘋果酸和檸檬酸的積累，施鎂處理更有利于蘋果酸的積累，施錳處理更有利于檸檬酸的積累。

2.5 鎂、錳對烤煙部分高級脂肪酸含量的影響

2.5.1 油酸 圖4a顯示，烤煙油酸含量隨生育期推進呈先增后減的趨勢。與CK相比，施用鎂、錳可以顯著增加烤煙油酸含量，且在一定范圍內(nèi)隨施用量的增加而增加。團棵期，T1、K1、T2、K2處理烤煙油酸含量分別較CK提高15.21%、18.43%、35.02%、52.53%；旺長期分別提高18.16%、16.88%、38.36%、34.27%；成熟期分別提高18.66%、9.51%、27.46%、24.30%。

2.5.2 亞油酸 圖4b顯示，不同處理烤煙亞油酸含量的變化規(guī)律與油酸基本相同。團棵期，T1、K1、T2、K2處理烤煙亞油酸含量分別較CK提高1.76%、25.29%、46.47%、52.94%；旺長期分別提高19.17%、9.22%、33.74%、28.88%；成熟期分別提高25.37%、12.87%、43.38%、36.76%。

圖4 鎂、錳對烤煙油酸(a)和亞油酸(b)含量的影響

綜上，鎂、錳均可促進烤煙油酸、亞油酸的積累，施鎂處理更有利于2種高級脂肪酸的積累。

3 結(jié)論與討論

西柏烷類致香物質(zhì)是煙葉中重要的致香前體物，通過一定的降解途徑可形成多種醛、酮等致香成分，從一定程度上影響烤煙的香氣質(zhì)及香氣量[27]。本研究結(jié)果表明，烤煙在生育過程中，中部煙葉α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇和β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量呈先升后降的趨勢，即旺長期>成熟期>團棵期，與趙華新等[28]的研究結(jié)果一致。可能是因為煙葉成熟后烤煙西柏三烯二醇易降解形成茄酮等致香類物質(zhì)導(dǎo)致西柏三烯二醇含量下降。韓錦峰等[8]研究表明，提高烤煙中西柏三烯二醇含量，可以有效改善烤煙的香氣質(zhì)，提高其香氣量。本研究表明，施鎂條件下，丙酮酸含量與DXP、IPP、(α、β)-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、DXP含量與IPP、α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、IPP含量與α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、α-與β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系；施錳條件下，丙酮酸含量與IPP、(α、β)-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、DXP含量與α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、IPP與(α、β)-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、α-與β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，可見，施用鎂、錳肥均可以促進烤煙DXP途徑的順利進行，促進烤煙西柏三烯二醇含量的積累，且施鎂比施錳效果更佳，其中，在20 g/株的施用水平下，相對效果最好?？赡苁且驗殒V、錳均作為糖酵解途徑、DXP途徑關(guān)鍵酶的催化劑，能夠活化反應(yīng)所需要的磷酸激酶，但錳的催化效果不如鎂好。同時，鎂作為葉綠素組分中的唯一金屬元素[1]，施用鎂肥更有利于提高烤煙葉綠素含量，增加光合產(chǎn)物含量，提高葉片淀粉積累量，為糖酵解產(chǎn)生丙酮酸提供充足的原料。丙酮酸作為DXP途徑的起始物質(zhì)，其含量增加可以促進下游關(guān)鍵產(chǎn)物DXP、IPP含量增加，進而更有利于烤煙西柏三烯二醇含量的積累。

蘋果酸能夠降低煙氣的pH值，改善高生物堿的煙草煙氣; 而檸檬酸含量較高則會降低煙葉質(zhì)量，導(dǎo)致吃味變差；不飽和脂肪酸能夠增加煙氣的豐滿度和粗糙感。煙草生長發(fā)育過程中，蘋果酸、檸檬酸等非揮發(fā)性有機酸的生物合成和降解主要發(fā)生在三羧酸循環(huán)中[19]。符新妍等[29]研究表明，烤煙在葉齡40 d前，代謝旺盛，呼吸作用產(chǎn)生大量蘋果酸，一定程度抑制了蘋果酸脫氫酶的活性，導(dǎo)致檸檬酸含量降低，隨葉齡增加，蘋果酸積累速度下降，底物反饋抑制效應(yīng)削弱，蘋果酸脫氫酶活性逐步增加，最終表現(xiàn)為蘋果酸含量呈現(xiàn)緩慢增加趨勢；而檸檬酸含量則先降低后緩慢增加，與本試驗結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，施用鎂、錳肥之后，烤煙的蘋果酸、檸檬酸含量均有不同程度的提升。姚莉等[30]認(rèn)為，施鎂可以顯著提高煙葉中非揮發(fā)性有機酸和高級脂肪酸的含量，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，施用鎂、錳可以調(diào)控烤煙中DXP途徑的進行，顯著提高烤煙西柏三烯二醇及部分有機酸、高級脂肪酸的含量，施鎂效果優(yōu)于施錳，硫酸鎂施用量為20 g/株效果最好。但由于試驗設(shè)計及條件的限制，對于是否存在更佳的鎂肥、錳肥施用量有待進一步研究。