嚴(yán)瑾 施開(kāi)創(chuàng) 劉宏梅 謝守玉 覃勇 黎宗強(qiáng) 尹彥文

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530005；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧530001；3.百色市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 百色市533000）

病毒性腹瀉是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一類重要疫病，豬德?tīng)査跔畈《荆≒DCoV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PRoV）是其中4種主要病原。PEDV可以感染各個(gè)年齡段豬群，發(fā)病豬以厭食、水樣腹瀉、嘔吐以及脫水為主要癥狀。該病毒在1971年首次被英國(guó)學(xué)者報(bào)道，中國(guó)1980年首次報(bào)道該病，目前世界上主要養(yǎng)豬國(guó)家均有該病流行［1］。PDCoV是2014年新發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道致病性冠狀病毒，可致各個(gè)年齡豬尤其是仔豬的嘔吐、腹瀉、脫水甚至死亡，臨床癥狀與PED相似［2］。TGEV于1946年美國(guó)首次分離得到，可以導(dǎo)致各種年齡豬的急性胃腸道傳染病，臨床癥狀與PDCoV極其相似，仔豬死亡率可達(dá)100%，成年豬極少死亡［3］。PRoV在1968年首次分離得到，臨床癥狀與PEDV相似，各種年齡豬均易感，成年豬多呈隱性感染，仔豬發(fā)病率和死亡率較高［4］。PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV所致疫病不僅臨床癥狀相似，還經(jīng)常存在混合感染、繼發(fā)感染，增加豬群的發(fā)病率和死亡率，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原。加強(qiáng)上述四種病原的流行病學(xué)調(diào)查，是做好病毒性腹瀉防控的重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2017-2019年來(lái)自廣西各地規(guī)模化豬場(chǎng)送檢的因腹瀉死亡豬的腸道及其內(nèi)容物、病豬的肛門拭子等腹瀉樣品，共1463份，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0核酸抽提試劑盒、PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taq PCR Master Mix試劑盒、DL2000 DNA Marker等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病料處理

肛門拭子的處理：將肛門棉拭子置于1.5 mL離心管中，按1∶3（W/V）加入滅菌生理鹽水，震蕩后離心，取200μL上清液，進(jìn)行RNA抽提。

糞便的處理：將糞便加入1.5 mL離心管中，按1∶3（W/V）加入滅菌生理鹽水，震蕩離心，取200μL上清液，進(jìn)行RNA抽提。

腸組織及內(nèi)容物的處理：選取腸組織及內(nèi)容物，剪碎，置于滅菌1.5 mL離心管中，按1∶3（W/V）加入滅菌生理鹽水，再加入兩顆研磨鋼珠，經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取200μL上清液，進(jìn)行RNA抽提。

按照核酸抽提試劑盒說(shuō)明書，提取樣品RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PDCoV、PEDV、TGEV及PRoV的檢測(cè)

參照本實(shí)驗(yàn)室建立的PDCoV、PEDV、TGEV及PRoV多重RT-PCR檢測(cè)方法［5］，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV擴(kuò)增片段大小分別為183 bp、750 bp、544 bp、329 bp。在陰、陽(yáng)性對(duì)照成立前提下，當(dāng)出現(xiàn)擴(kuò)增的目的條帶時(shí)，判定為陽(yáng)性；否則為陰性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)不同年度、季節(jié)、地區(qū)和病種的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，利用卡方檢驗(yàn)計(jì)算器V1.70發(fā)生數(shù)格式、確切概率計(jì)算卡方進(jìn)行差異性分析，當(dāng)P≤0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原檢測(cè)結(jié)果

2017-2019年從廣西各地養(yǎng)豬場(chǎng)采集的1463份腹瀉病料進(jìn)行多重RT-PCR，檢測(cè)PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV如表1所示。由表1可見(jiàn)，PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV的檢出陽(yáng)性率分別為5.67%、10.12%、1.30%和5.95%。2017-2019年，廣西部分地區(qū)PDCoV陽(yáng)性率分別為8.33%、5.81%和3.82%，陽(yáng)性率呈逐年下降，2019年同比2017年下降差異顯著（P≤0.05）；PEDV陽(yáng) 性 率 分別為12.70%、9.72%和9.31%，各年差異不顯著（P＞0.05）；TGEV陽(yáng)性率分別為0%、1.77%和1.19%，2018年和2019年差異不顯著（P＞0.05）；PRoV陽(yáng)性率分別為0.40%、6.31%和8.59%，2019年同比2017年顯著上升（P≤0.05）。結(jié)果表明，2017-2019年間廣西部分地區(qū)PDCoV、PEDV陽(yáng)性率不斷下降，而PRoV陽(yáng)性率則在逐年上升。

表1 2017-2019廣西各地臨床腹瀉樣品檢測(cè)結(jié)果

2.2 病原時(shí)間分布

對(duì)1463份病料的檢測(cè)結(jié)果按季節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（見(jiàn)表2），2017-2019年四個(gè)季度中，PDCoV陽(yáng)性率最高為第二季度，達(dá)10.14%，與第一、四季度差異顯著（P≤0.05），與第三季度差異不顯著（P＞0.05）；PEDV陽(yáng)性率最低為第二季度4.06%，并與其他季度差異顯著（P≤0.05），第一、三、四季度間差異不顯著（P＞0.05）；TGEV陽(yáng)性率最高為第三季度5.50%，并與其它季度差異顯著（P≤0.05），第一、三、四季度間差異不顯著（P＞0.05）；PRoV陽(yáng)性率最低為第二季度1.45%，并與其他季度差異顯著（P≤0.05），第一、三、四季度間差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，PEDV全年均可發(fā)病，高峰期在第二、三季度，第一、四季度發(fā)病率相對(duì)較低；PDCoV主要在冬春季節(jié)發(fā)生，但感染豬場(chǎng)全年都可發(fā)??；TGEV主要集中在第三季發(fā)生，第二季度未檢測(cè)出陽(yáng)性；PRoV一年四季均可檢測(cè)出陽(yáng)性，第二季度陽(yáng)性率相對(duì)比較低。

表2 2017-2019廣西各地腹瀉樣品檢測(cè)結(jié)果季度統(tǒng)計(jì)表

2.3 病原地區(qū)分布

2017-2019年從廣西9個(gè)地級(jí)市采集的1463份腹瀉病料PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV檢測(cè)結(jié)果如表3所示。由表3可知，根據(jù)相同病原在不同地區(qū)的平均陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)顯示，PDCoV陽(yáng)性率在百色市最高，為9.25%，與其他地區(qū)差異顯著（P≤0.05）；PEDV陽(yáng)性率在玉林市最高，陽(yáng)性率為50.00%，但由于樣本數(shù)比較少，與多數(shù)地區(qū)差異不顯著（P＞0.05）；TGEV陽(yáng)性率在桂林市最高，為33.32%，除與南寧市差異不顯著外，與其他地區(qū)差異顯著（P≤0.05）；PRoV陽(yáng)性率在賀州市最高，為50.00%，與其他地區(qū)差異顯著（P≤0.05）。結(jié)果表明，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的發(fā)生具有地域差異性。

表3 2017-2019廣西各地腹瀉樣品檢測(cè)結(jié)果地區(qū)分布統(tǒng)計(jì)表

2.4 PDCoV與PEDV、TGEV、PRoV混合感染情況

PDCoV與PEDV、TGEV、PRoV混合感染情況如表4所示。由表4可知，在所檢測(cè)的1463份病料中，2種病原混合感染的陽(yáng)性率為5.26%，3種病原混合感染的陽(yáng)性率為1.64%。PEDV+PDCoV、PEDV+TGEV、PEDV+PRoV陽(yáng)性率分別為2.32%、0.21%、2.19%；PDCoV+TGEV、PDCoV+PRoV陽(yáng) 性 率 為0.27%、0.27%；TGEV+PRoV陽(yáng)性率為0.14%；PDCoV+PEDV+PRoV三重感染陽(yáng)性率為1.64%。

表4 2017-2019廣西各地臨床腹瀉樣品混合感染情況

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)，由各種豬腹瀉病毒感染所造成的豬群發(fā)病率和死亡率不斷升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。徐麗華等［6］調(diào)查2011-2017年浙江省部分豬群，發(fā)現(xiàn)PEDV、PDCoV、TGEV和PRoV陽(yáng)性率分別為71.25%、8.75%、3.05%和17.67%；混合感染中，PEDV+PDCoV、PEDV+TGEV、PEDV+PRoV、PDCoV+PRoV陽(yáng)性率分別為2.80%、2.40%、15.10%、0.50%。王顥然等［7］對(duì)2008-2018年我國(guó)PEDV混合感染病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)全國(guó)18個(gè)省市6951份樣本中，PEDV陽(yáng)性3345份，陽(yáng)性率為48.12%、混合感染1325份，陽(yáng)性率為19.06%，混合感染主要以二重為主陽(yáng)性率為15.41%，三重、四重混合感染分別為3.25%和0.40%。田云等［8］對(duì)廣東省19個(gè)地市236份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，PEDV陽(yáng)性率為33.05%，PRoV陽(yáng)性率為17.8%，未檢出TGEV。李炳曉等［9］對(duì)2017-2018年河南省部分地區(qū)仔豬腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，PEDV、PDCoV陽(yáng)性率分別為35.06%、51.92%，二者混合感染陽(yáng)性率為24.03%。何穎等［10］對(duì)2013-2018年廣西各地1574份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，PEDV、PDCoV、TGEV和PRoV陽(yáng)性率分別為54.94%、4.52%、4.40%和0%，混合感染中以PEDV+PDCoV和PEDV+PRoV混合感染較多，三重感染情況較少；PEDV四季的感染率分別為50.43%、45.19%、60.49%和63.19%，PDCoV四季的感染率分別為8.12%、1.56%、0.49%和5.11%，PRoV四季的感染率分別為5.34%、8.05%、3.41%和1.02%。段群棚等［11］對(duì)廣西2016-2019年914份病料進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)PEDV無(wú)明顯的發(fā)病季節(jié)，夏季豬群也會(huì)持續(xù)感染，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV等是引起仔豬腹瀉的重要病原，而且存在混合感染、繼發(fā)感染情況。

本研究對(duì)2017-2019年廣西各地的腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的陽(yáng)性率分別為5.67%、10.12%、1.30%和5.95%；2種病原混合感染的陽(yáng)性率達(dá)到5.26%，三種病原混合感染的陽(yáng)性率達(dá)到1.64%。結(jié)果表明，PEDV是導(dǎo)致豬腹瀉的主要病原，PDCoV、TGEV和PRoV也有感染，而且混合感染較為嚴(yán)重。在不同地區(qū)、不同季度可能會(huì)感染不同的病原，病原之間可能存在相互作用，導(dǎo)致不同的發(fā)病率和死亡率［12］。與其他省份相比，廣西豬群TGEV、PEDV以及PRoV的陽(yáng)性率普遍低于其他省份，這可能與廣西部分豬群接種PEDV-TGEVPRoV三聯(lián)弱毒苗有關(guān)，疫苗的接種能夠有效的預(yù)防腹瀉的發(fā)生，降低發(fā)病率和死亡率。但目前尚未有PDCoV商品化疫苗，對(duì)該病的防控，可以通過(guò)對(duì)環(huán)境的控制來(lái)降低豬群的感染率和發(fā)病率［13］。廣西豬群的腹瀉主要發(fā)生在冬春季節(jié)，可能是由于廣西屬于亞熱帶地區(qū)，每年冬春季節(jié)，廣西地區(qū)陰雨連綿，氣候潮濕陰冷，晝夜溫差大，容易引起豬群的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致豬群的免疫力下降，誘發(fā)腹瀉。因此，要在冬春季節(jié)，在免疫相應(yīng)疫苗的基礎(chǔ)上，應(yīng)注意豬群的防寒保暖，保持豬圈通風(fēng)干燥，堅(jiān)持定期消毒，增加飼料營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)加強(qiáng)生物安全管理和飼養(yǎng)管理來(lái)降低豬群的發(fā)病率和死亡率。

總之，PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV已成為當(dāng)前豬群病毒性腹瀉的主要病原，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)病原監(jiān)測(cè)，做好疫苗免疫、飼養(yǎng)管理、生物安全等綜合防控，持續(xù)降低豬群病毒性腹瀉的發(fā)病率和死亡率。