李偉明 胡會剛 胡玉林 段雅婕 陳晶晶 謝江輝 王文華

摘 ?要：雌、雄性高度不育等因素導致現(xiàn)有栽培蕉遺傳基礎狹窄、抗逆力衰退，雜交育種是拓展其遺傳多樣性并改良關鍵農藝性狀的重要途徑，但國內外鮮見相對系統(tǒng)的研究報道。為了尋找可雜交利用的父、母本材料，本研究對3份野生父本材料Musa acuminata、Musa balbisiana和Musa cheesmani的花粉活力進行檢測，然后以5類栽培蕉，即香芽蕉（AAA）、粉蕉（AAB）、大蕉（AAB）、龍牙蕉（ABB）和皇帝蕉（AA）的多份代表性品種為母本，兩兩組合進行雜交，檢測不同組合的結籽率、種子萌發(fā)率、正常苗率。結果表明：母本基因組型為ABB的品種均可結籽;與另外2份野生蕉相比，M. balbisiana作為父本時結籽率、種子萌發(fā)率和正常苗率3項指標總體上最為理想;近緣野生種M. cheesmani與栽培品種雜交可以獲得后代。本研究較為系統(tǒng)地開展了香蕉雜交試驗，取得了多項數(shù)據(jù)，可為國內外尤其是國內正在興起的香蕉雜交育種研究提供參考。

關鍵詞：香蕉;雜交育種;野生種;親緣關系;雜交親和性

中圖分類號：S668.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The majority of banana cultivars are male sterility， which give rise to the lack of banana diversity and varie-ties recession in resistance. The cross-breeding deserves a good strategy for the improvement of genetic diversity and agronomic traits. In order to find out the genotypes qualified as male and female parents， we conducted large-scale cross-breeding among three wild relatives and various cultivars. The pollen activity was examined for the wild relatives of Musa acuminata ssp. malaccensis （AA）， Musa balbisiana （BB） and Musa cheesmani. The pollen staining rate （> 63%） was high for all species. Popular cultivars Musa AAA， Musa AAB， Musa ABB including Pisang Awark and Da jiao， Musa AA were cross-bred with the wild relatives （male）. The seed set， seed generation and seedling morphological trait were observed to evaluate the cross-compatibility of different combinations. Only Musa ABB could set seeds. The seed set， seed generation and seedling morphological trait for M. balbisiana were much better. M. cheesmani was compatible with some cultivars. The study would provide reference dataset for worldwide banana researchers.

Keywords： Musa; cross breeding; wild relatives; phylogenetic relationship; cross-compatibility

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.016

香蕉（Musa spp.）是世界第八大、欠發(fā)達國家第四大糧食作物[1];是僅次于柑橘的第二大水果，更是貿易量最大的鮮果。我國2019年栽培面積495.6萬hm2，產量1165.6萬t，分別排世界第6位和第2位[2]。然而，栽培品種主要僅由Musa acuminata（提供A基因組）和Musa balbisiana（提供B基因組）2個原始野生種通過種內或種間雜交衍生而來;又以三倍體或多倍體為主，不結種子，長期無性繁殖;且以大面積單一品種種植模式實行商業(yè)化栽培[3]，這些因素導致遺傳多樣性嚴重損失、抗逆性變劣，病蟲害日益適應[4-5]。一旦受到某種流行性病蟲害的侵染就有可能出現(xiàn)快速蔓延的局面，帶來毀滅性打擊[6-7]，例如黑星病和枯萎病都曾毀掉過數(shù)十萬公頃蕉園[8-9]。

香蕉的傳統(tǒng)育種方法主要是芽變選種，該法曾對香蕉產業(yè)起到巨大作用，但由于可挖掘和利用的優(yōu)良性狀基因資源有限，篩選得到的變異優(yōu)株越來越難以應對不斷出現(xiàn)的新逆境。與栽培種質不同，香蕉野生近緣種由于長期適應殘酷自然環(huán)境，含有大量抗病抗逆基因，是栽培香蕉遺傳改良的寶貴基因庫[10-11]。因此，通過雜交將野生種的優(yōu)良基因轉移到栽培品種中，以拓寬栽培品種的遺傳基礎，再從多樣性豐富的雜交后代群體中篩選出可商業(yè)化推廣種植的優(yōu)良新品種的育種策略，正逐漸成為香蕉育種科技人員的共識，受到越來越多的關注和重視。

國外曾有多家機構開展香蕉雜交育種工作，如巴西的EMBRAPA-CNPMF、洪都拉斯的FHIA等;國內香蕉雜交育種起步較晚，直到最近幾年才有多個研究團隊陸續(xù)開展工作[12-13]。他們發(fā)現(xiàn)三倍體栽培品種并非完全不育，而是有少量品種保留了微弱的雌性可育性，若選取雄性育性較高的AA或BB基因組類型的二倍體香蕉作為父本，通過人工授粉與栽培品種雜交，可獲得少量種子，進而獲得雜交后代實生苗群體[14-17]?？墒牵陨鲜兰o30年代出現(xiàn)香蕉雜交育種報道[18]算起，至今已過去80多年的時間，仍未有1個香蕉人工雜交品種成功獲得商業(yè)化應用。說明香蕉雜交育種仍面臨諸多困難、工作進展緩慢[19-20]。這與現(xiàn)有文獻中普遍缺乏基于嚴格試驗獲得的香蕉雜交過程中授粉、收獲種子、后代培育等諸多環(huán)節(jié)的具體數(shù)據(jù)，導致實際育種操作沒有現(xiàn)成模式可循有關。

因此，國內香蕉雜交育種工作需先從以下2個方面開展基礎工作，一是篩選尚保存有微弱雌性可育性的栽培品種作為母本，二是篩選與這些栽培品種具有較高親和性的雄性可育性材料作為父本。鑒于此，本研究以雄性高度可育的3份野生種為父本，以5大類型栽培蕉的多個品種為母本，開展雜交試驗，篩選親和性組合，為國內初興的香蕉雜交育種熱潮提供數(shù)據(jù)參考，并為后繼基礎研究和雜交育種實踐奠定材料基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?雜交親本與栽培管理

1.1.1 ?親本材料 ?本研究在廣東省湛江市麻章區(qū)湖秀路1號中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所香蕉試驗基地進行。以結籽的野生蕉為父本，以單性結實且無籽的栽培蕉為母本。野生蕉包括M. acuminata ssp. malaccensis（AA）、M. balbisiana（BB）和Musa cheesmani（圖1）。之所以選擇這3份材料，是因為它們與栽培蕉具有最密切的親緣關系：絕大部分現(xiàn)有栽培品種來自于M. acuminata （含A基因組）的種內雜交以及其與M. balbisiana（含B基因組）的種間雜交;M. cheesmani采集于交通極端落后的西藏墨脫縣，在所有野生種中它與M. balbisiana的親緣關系最近[21]。栽培蕉主要分為香芽蕉、龍牙蕉、大蕉、粉蕉和皇帝蕉5類，為了了解每類蕉的雜交效果，本研究每類選擇至少2個品種。

1.1.2 ?田間管理 ?為雜交親本建設雜交圃，圃中每行種植同一份材料16～20株。為了方便采集花粉和授粉，每種植4行栽培品種則搭配種植1行野生種，株、行距規(guī)格為2 m×3 m。田間管理與大田生產相似，但肥水管理上以施放有機肥為主，促使植株生長健壯、抗逆力強;行間鋪地膜，以限制雜草生長且方便授粉等田間操作。

1.2 ?花粉活性檢測

前人研究表明，TTC與MTT染色法處理后香蕉花粉形態(tài)較清晰，容易區(qū)分染色與未染色的花粉[12]，故本研究采用MTT染色法[22]檢測3份父本材料的花粉活性。選取生長良好、已抽蕾4周以上并有完整雄花蕾的植株作為采樣樹。剝取雄花蕾最外層苞片下的雄花序，放入已滅菌的保鮮袋中，迅速送至實驗室，立即進行花粉活力的測定[12]?；ǚ鄞婊盥视嬎愎剑?/p>

染色率=（染色花粉粒數(shù)/花粉總數(shù)）×100%

選取3～5個視野進行統(tǒng)計，取平均值。每份材料重復染色制片3次。

1.3 ?雜交組合和人工授粉

每份父本均和每份母本進行雜交，共雜交3個生育周期（3造），每期均在雨水偏少、天氣涼爽，授粉效果較好的秋冬季進行，即2017、2018和2019年的9—11月。每個周期每份母本選取15株以上生長健壯、無病害的植株進行授粉。香蕉花序為無限花序，雌花首先開放，果實可正常發(fā)育;中性花和雄花緊接著開放，但無法發(fā)育成正常的果實，因此授粉時只授雌花;又由于母本無花粉（花粉敗育），故無需進行去雄處理。

授粉在8：00—10：00進行，取當天開放的父本花朵，用手指輕輕搓捏至花粉大量暴露后，拿著小花基部直接將花粉涂抹到母本植株苞片剛剛打開的雌花柱頭上，涂抹時動作輕柔，避免傷到柱頭，并盡量多涂抹些花粉。每個品種每梳雌花均進行授粉;根據(jù)前期試驗結果，對可以獲得種子的基因組型為ABB的材料進行套袋，即授粉后單梳套上塑料鞋套，防止昆蟲、風力引起花粉漂移參與授粉。套鞋套3 d天后柱頭呈褐化變黑狀，此時已喪失受粉能力，即可去除套袋。對幾乎未能收獲到種子的其他3類基因型（AAA、AAB、AA）品種，則未進行套袋處理，以節(jié)省大量勞動力。授完最后一梳雌花后，待再開出3～5片苞片時進行斷蕾。自授粉開始，對植株進行精心管理，以保證植株正常生長、果實發(fā)育良好。當發(fā)現(xiàn)果穗中有果指成熟時，即采收整串果穗，轉移到溫棚內自然催熟。待大部分果指變黃成熟時，將整串果穗的全部果指逐個切開，從果肉中取出全部種子，記錄果指數(shù)和種子數(shù)。

1.4 ?常規(guī)播種和小苗管理

種子萌發(fā)和小苗培育在溫室進行，溫度保持在30 ℃左右。萌發(fā)基質為有機質（草炭）∶沙子∶紅壤土=1∶1∶1，使用前混合均勻。每個雜交組合收獲的種子自然晾干后，隨機選取300顆飽滿的種子（父本M. balbisiana的種子為對照），均勻水平播種于盛有萌發(fā)基質的花盆中，再在種子上加少量基質進行覆蓋，并以薄膜覆蓋盆口保濕。日常用滅菌后的霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液澆灌，保持土壤濕度在70%～80%;如發(fā)現(xiàn)有菌絲生長，及時噴灑少量0.3%的多菌靈懸浮液。小苗生長到高度為10～15 cm時移栽到營養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，每兩星期淋肥一次。2個月后，袋苗如能正常生長，即假莖和葉片均表現(xiàn)正常的植株計算為正常苗，出現(xiàn)畸形的統(tǒng)計為畸形苗。正常苗率計算公式為：正常苗率=[正常苗數(shù)/（正常苗數(shù)+畸形苗數(shù)）]× 100%

1.5 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.1軟件進行，采用LSD法分析不同雜交組合間的結籽率、種子萌發(fā)率、正常苗率的差異顯著性（P<0.05）。

2 ?結果與分析

2.1 ?3份野生近緣種的花粉活力

從圖2可以看出，用MTT染色法處理后香蕉花粉的形態(tài)比較清晰，染色與未染色的花粉容易區(qū)分，此效果與鄧彪的研究結果相似[12]。進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，M. acuminata、M. balbisiana和M. cheesmani的染色率分別為73.1%、68.5%和63.9%，說明3份種質的花粉染色率均較高，達到60%以上，非?？赡芫哂休^強的可育性。

2.2 ?母本開花特性描述

香蕉花序開花呈漸進性，從第一梳雌花開放到最后一梳開放所需時間依品種和溫度而不同。本研究采用的品種較少的有8梳左右（大蕉類），多的有15梳左右（金沙香），因此不同品種雌花完全開放需要10～30 d不等的時間。通過調整吸芽的留芽時間，各組合的授粉時期均為9—11月，但由于不同母本的生育周期差別較大，導致不同雜交組合果實成熟采收時期也相差較遠?？傮w上，雜交后2.5～6個月果實成熟，即可收獲種子。

2.3 ?不同雜交組合的效果比較

2.3.1 ?不同組合的結籽效果 ?從表1和表2中可以看出母本具有以下特點：（1）不同品種果指數(shù)量主要由基因型決定，差別較大。即不管是同類型品種（香芽蕉類除外），還是同基因組型品種（AAA型除外），果指數(shù)量差異均達到顯著水平。（2）單株最高種子數(shù)差別很大，且主要由品種類型和基因組型決定。即香芽蕉類（AAA）和龍牙蕉類（AAB）母本均沒能結籽;皇帝蕉類（AA）僅有‘玫瑰蕉'的個別植株可收獲個別種子;基因型同為ABB的大蕉類和粉蕉類單株最多可收獲數(shù)十到過百顆種子。（3）平均單株種子數(shù)差別較大，且主要由基因組型決定。即基因組型為ABB時，單株平均可收獲約20～60顆種子，且大蕉類品種結籽數(shù)顯著多于粉蕉類品種;其余3種基因組型單株結籽數(shù)為零或幾乎為零。（4）平均單果結籽率與平均單株種子數(shù)指標相似，即大蕉類單果結籽率達0.30～0.68顆/果，粉蕉類為0.11～0.26顆/果，其余3種類型為0顆/果，此指標與不同品種果指數(shù)差異無關，故可更直觀有力地表明大蕉類品種結籽率顯著高于粉蕉類品種。

總的來說，香芽蕉類、龍牙蕉類和皇帝蕉類幾乎沒有種子，表現(xiàn)出高度母性不育性，故后文將不再討論其種子萌發(fā)率和正常苗率;粉蕉類與大蕉類相比，前者果指數(shù)多，但結籽率低，導致單株結籽數(shù)量較少，后者的情況恰好相反。

在母本一方保存有微弱可育性（ABB基因組型）的情況下，父本一方有如下整體表現(xiàn)：無論是平均單株種子數(shù)還是平均單果種子數(shù)，M. balbisiana均顯著高于M. acuminata與對應母本的組合;M. cheesmani、M. balbisiana與大蕉類雜交均表現(xiàn)出相似的最佳結籽效果（達到50.2～60.3顆/株和0.50～0.68顆/果）;M. cheesmani、M. acuminata與粉蕉類組合的結籽效果情況相似，僅有19.7～22.7顆/株和0.11～0.14顆/果，顯著低于M. balbisiana與粉蕉類組配的效果（達到26.9～ 38.4顆/株和0.15～0.26顆/果）。這些結果說明為當母本具有微弱可育性時，父本基因型對結子率有較大影響。

2.3.2 ?不同組合的種子萌發(fā)率和小苗生長效果 ?從表1和表2還可以看出，雜交種子的萌發(fā)率極低，總體上約為2.0%左右。就母本而言，大蕉類種子萌發(fā)率普遍略高于粉蕉類種子。就父本而言，M. balbisiana與ABB基因組型4個品種的組合效果最佳，達到2.1%～4.4%，總體上顯著高于M. acuminata或M. cheesmani與對應品種的組合（1.0%～2.0%）。

從表1和表2還可以看出，雜交實生苗大量出現(xiàn)畸形，正常苗率可不足半數(shù)。具體而言，父本相同時，粉蕉類后代的正常苗率（40.7%～ 86.2%）常顯著高于大蕉類后代（31.3%～65.1%）;而母本相同時，M. balbisiana與ABB基因組型品種組合的正常苗率（51.2%～86.2%）均顯著高于M. acuminata或M. cheesmani與對應品種的組合（分別為31.3%～68.1%和35.1%～47.2%），另外，M. acuminata與粉蕉類組合的正常苗率（63.9%～ 68.1%）顯著高于M. cheesmani與粉蕉類的組合（40.7%～47.2%）。

綜合種子萌發(fā)和小苗生長2項指標可以看出，就母本而言，大蕉類種子萌發(fā)率高，但正常苗占比少，粉蕉類的情況恰好相反;就父本而言，M. balbisiana后代的2項指標均優(yōu)于M. acuminata或M. cheesmani后代，而M. acuminata與粉蕉類組合的后代則好于M. cheesmani與粉蕉類的后代。

3 ?討論

奇數(shù)染色體在減數(shù)分裂時聯(lián)會配對紊亂，無法產生正常配子，理論上是不育的[23];但實踐中發(fā)現(xiàn)染色體存在非等量分離重組及不減數(shù)分裂等現(xiàn)象，導致配子體形成過程中可能出現(xiàn)可育性配子[24]。這可能是少量三倍體栽培香蕉品種具有微弱雌性可育性的原因。另一方面，盡管選擇的父本二倍體材料本身是可育的，但由于父、母本均長期采用營養(yǎng)器官進行繁殖，可能存在雙親親緣關系較遠、遺傳差異較大、生理不協(xié)調等現(xiàn)象，從而影響受精過程，使雌、雄配子不能結合形成合子，進行人工授粉時可能出現(xiàn)類似于遠緣雜交不親和的現(xiàn)象[18]。

考慮到本研究的3份父本材料花粉染色率高達63.9%～73.1%，此結果與鄧彪[12]的結果相似;且授粉時抹到柱頭上的花粉粒數(shù)量非常龐大，故應該不存在雄配子體數(shù)量不足和質量不好的問題。在此前提下，不同父本與同一可育母本分別進行雜交，其結籽率、種子萌發(fā)率、正常苗率卻存在差異，說明不同雙親的親和力存在差異。父本M. acuminata和M. balbisiana的親緣關系較遠，但它們作為栽培蕉的2個祖先種，與栽培品種的關系應該比較近緣（即雜交應該親和）;M. cheesmani是野生種中與M. balbisiana親緣關系最近的種[21]，但它不是栽培品種的祖先種，與栽培品種雜交是否親和需要試驗驗證。本雜交試驗結果是，母本基因組型為ABB時，3個父本與其雜交均能收獲種子，但效果差異較大，此結果與趙明等[13]的研究結果相似。再進一步比較，可發(fā)現(xiàn)當M. balbisiana作為父本時，結籽率、種子萌發(fā)率、正常苗率均比較理想;而M. acuminata作為父本時，除了結籽率和種子萌發(fā)率略低外，還產生大量畸形苗;意外的是M. cheesmani作為父本也可以成功獲得后代實生苗，只是效果相對M. balbisiana來說比較差，與M. acuminata作為父本的情況相似（表1，表2）。這些結果的一個可能解釋是，母本基因組由1個A和2個B組成，即含B的成分相對較多，因此與父本M. balbisiana的親緣關系可能比較近，故親和性高，此猜測與Simmonds[18]通過總結前人的研究結果得出的結論相類似;父本M. acuminata的情況與此剛好相反;而M. cheesmani之所以成功，是因為與M. balbisiana的親緣關系非常近，可能是由M. balbisiana分化而來的姐妹種，其基因組中可能含有大量與M. balbisiana相近或甚至相同的成分。值得高興的是，M. cheesmani與栽培品種具有雜交親和性的結果也提示我們，除了祖先種外，其他野生近緣種也可以用作父本資源對栽培蕉進行雜交改良;當然，因為畸形苗占比較高等不良結果，遠緣父本的應用會大幅度增加工作量[25]。

本研究通過測試3份花粉具有高度可育性的野生近緣種與5種類型共37份栽培品種的雜交效果發(fā)現(xiàn)：基因組型為AAA和AAB的香芽蕉類和龍牙蕉類均無法結籽;組型為AA的皇帝蕉類中僅‘玫瑰蕉'有個別植株可收獲個別種子，但沒有萌發(fā)成功;組型為ABB的粉蕉類和大蕉類，均能收獲較多種子，且有少量種子可以萌發(fā)并正常生長。這些結果表明，母性本身是否具有可育性是雜交能否成功的決定因素。鄧彪[12]的研究也表明父本相同時，基因組型為ABB的品種做母本均可雜交成功，但在收獲種子數(shù)、種子萌發(fā)率兩方面存在顯著差異。結合本研究AAA型、AAB型、AA型均幾乎無法結籽，而ABB型可結籽的情況來看，可推測香蕉在形成單性結實特征的進化過程中，基因組AA完全或幾乎完全喪失了具有可育性的成對等位基因;但基因組BB則一定程度上保留了單個或成對的可育基因。至于ABB型育性完勝AAB型的原因，一個可能的解釋是，基因組為ABB時，減數(shù)分裂過程配子體有較大機會保留一套相對完整具有可育基因的B基因組，導致配子體可育;而為AAB時，減數(shù)分裂過程很難保留完整的成套B基因組，造成配子體敗育。

總的來說，本研究通過大量雜交試驗，發(fā)現(xiàn)不同雜交組合的效果差異巨大，篩選出一些具有較好親和性的組合;揭示即使是親和的組合，其結籽率、種子萌發(fā)率均較低，且存在大量畸形苗的現(xiàn)象;反映不同組合存在不同程度的雜交不親和性和雜種育性障礙。鄧彪[12]、趙明等[13]、Vuylsteke 等[26]、Silva等[27]的雜交試驗也有類似發(fā)現(xiàn)。由于國外文獻缺乏基于嚴格試驗設計獲得的香蕉雜交育種實驗數(shù)據(jù)，故這些研究結果可為國內正在興起的香蕉雜交育種熱潮提供寶貴的具體數(shù)據(jù)參考。至于香蕉雜交不親和與雜種育性障礙機制，國內外已有說法很多，但多是一些猜想，缺乏有力試驗數(shù)據(jù)的支持，故本文不過多討論。相反，我們認為要探明此機制還需從篩選材料開始做工作，即像本文那樣大量開展雜交組配試驗，篩選出高親和性組合甚至骨干親本后，再從中選擇材料開展基礎研究。

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責任編輯：崔麗虹