冉紫晶，葉青，趙敏，張詩琬，梅小平

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川南充637000

2018 版歐洲肝病學會《慢性乙型肝炎病毒感染管理臨床實踐指南》及2019版《慢性乙型肝炎防治指南》［1］中均增加了血清HBV核心相關抗原（HBcrAg）、血清HBV RNA及乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA這3種新型HBV感染與檢測的生物學標志物，其中HB‐crAg為一種混合型生物學標志物，由HBV前C/C區(qū)基因表達的幾種抗原共同構成。血清HBcrAg定量檢測與HBsAg的檢測結果互不重疊，血清中HBcrAg水平可部分反映HBeAg陽性患者肝細胞內HBV cccDNA的表達水平及轉錄活性，也可部分反映整合后的HBV DNA的轉錄活性與水平。HBV cccDNA的存在是HBV持續(xù)感染與復制的最直接生物學標志物［2-3］。目前，即使HBV感染相關患者血清中HBV DNA、HBsAg消失或發(fā)生血清學轉換，但肝細胞核中仍存在HBV cccDNA，肝細胞核內低表達的HBV cccDNA即可致HBV相關性肝病患者HBV復制、病情復發(fā)或肝細胞癌變的發(fā)生。由于HBV cccDNA存在于肝細胞內，需行創(chuàng)傷性肝組織穿刺活檢，且HBV cccDNA在肝內呈不均勻分布，因此HBV cccDNA的精準檢測難以在臨床上廣泛開展，但臨床上亟需尋找新型血清生物學標志物來精準反映肝組織內HBV cccDNA的表達水平及HBV轉錄程度與活性，其中HBcrAg、HBVpgRNA等表達水平可較好反映肝內HBV cccDNA的存在狀態(tài)與復制水平，具有廣泛的臨床應用價值，但血清HBcrAg檢測方法尚未標準化，可能與其在血清中低水平表達及相關研究數據少和尚未形成統(tǒng)一檢測標準等相關［4］。近年，隨著對HBcrAg研究的深入，血清HB‐crAg在HBV相關性肝臟疾病中的臨床應用情況取得一些研究進展，現綜述如下。

1 血清HBcrAg的構成與檢測方法

1.1 血清HBcrAg的構成HBcrAg作為HBV感染的血清生物學標志物之一，由HBeAg、HBcAg及核心相關蛋白（p22cr）構成，共享149個由C基因編碼的氨基酸編碼［4］。P22是由28～150氨基酸編碼構成的一種前核心蛋白，由前C/C基因區(qū)編碼和轉錄，表達于空缺的、無病毒核心的病毒顆粒中。P22多表達于HBV DNA陰性的病毒顆粒中且與HBV DNA構型無關。HBcAg、HBeAg及p22cr均為前C/C區(qū)的編碼產物。HBV進入肝細胞內并在肝細胞核中形成穩(wěn)定的HBV cccDNA后，HBV轉錄成多種相關mRNA并編錄各種結構和非結構蛋白。HBcAg是HBV衣殼的主要結構蛋白質，在完整的HBV Dane顆粒中表達。HBeAg作為一種非結構性HBV蛋白，是HBV前C區(qū)N端加工后的代謝產物，p22cr與HBeAg一樣，也是前C區(qū)N端加工后的代謝產物，在HBV DNA陰性和HBcAg缺乏的Dane樣顆粒中均可檢出。

1.2 血清HBcrAg的檢測HBcrAg主要通過化學發(fā)光酶聯免疫法檢測［5］。因HBcAg、HBeAg和p22cr具有相同的氨基酸編碼，故采用同一株單克隆抗體即可檢出這3種標志物，檢測HBcrAg時也就檢出了由HBV RNA前C/C基因區(qū)轉錄的HBcAg、HBeAg與p22crAg三種 蛋白 抗原 水 平。HBcAg與p22crAg在血清中分別與相應的抗體結合形成抗原抗體復合物，HBcAg與p22crAg表達于HBV構型中，在同一單克隆抗體不易測出。HBcrAg檢測時，血清樣本需經預處理后使HBeAg和HBcAg與抗-HBe和抗-HBc所形成的抗原-抗體復合物中游離出來，解離HBeAg和HBcAg抗原的立體結構成直線狀態(tài)，并呈現出其游離狀態(tài)，此時再使用同一單克隆抗體后即可檢測［6］。主要通過血清標本與抗HBcrAg包被的微孔板混合成抗原—抗體免疫復合物，再用堿性磷酸酶標記后的抗HBcrAg來結合微孔板上的免疫復合物并形成抗原—抗體—酶標復合物，通過測定樣品中復合物的發(fā)光強度即可檢測血清HBcrAg水平。對于高濃度的HBcrAg可通過稀釋樣品來檢測，在抗HBc或抗HBe陽性樣本中也可精確地檢出HBeAg和HBcAg的表達水平，HBcrAg檢出的精度與HBeAg的表達模式及是否有HBeAg陰性及核前區(qū)突變無關［7］。HBcrAg定量檢測與HBsAg的檢測結果不重疊，血清中HBcrAg水平可部分反映肝細胞內cccDNA的表達水平及轉錄活性，也可反映整合后的HBV DNA的轉錄活性及復制狀態(tài)。

2 HBV相關性肝臟疾病患者中血清HBcrAg檢測的臨床應用

2.1 預測HBV相關性肝臟疾病患者肝組織中HBV cccDNA水平有研究發(fā)現，CHB患者循環(huán)血清中HBcrAg水平與肝內HBV cccDNA表達水平關系密切（r=0.929，P＜0.001），結果顯示，肝內HBV cccDNA表達水平及變化與循環(huán)血清HBsAg和HBcrAg水平變化相一致，初步認為，循環(huán)血清HBcrAg水平與肝細胞內HBVcccDNA水平的正相關性較血清HBsAg或HBV DNA更強［8-9］。研究發(fā)現，對CHB患者循環(huán)血HBcrAg、HBV RNA和HBsAg與肝組織內HBV cccDNA表達水平比較，HBeAg（+）患者循環(huán)血清中HBcrAg水平與HBsAg和HBV RNA水平均正相關，其HBV RNA水平與HBsAg水平亦呈正相關；對于HBeAg（-）患者循環(huán)血清中HBcrAg、HBsAg與HBV RNA間無相關性。多因素線性回歸分析顯示，對于HBeAg（+）的CHB患者，其血清中HBcrAg、HBsAg和HBV RNA均 與HBV cccDNA表達水平顯著相關；而HBeAg（-）患者血清中HBcrAg與HBV cccDNA水平顯著相關［10］。提示CHB患者血清HBcrAg水平較HBsAg、HBV RNA能更好地反映HBV cccDNA的表達水平，與HBeAg的表達模式無相關性。筆者認為，檢測循環(huán)血中HBcrAg表達水平可較好地反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)與復制水平，這有利于評估抗HBV治療后停藥時機及療效的選擇。

研究發(fā)現，肝內cccDNA與肝內總HBV DNA的相關性最強（r=0.83，P＜0.0001），CHB患者血清中HBcrAg、HBV DNA與HBV cccDNA的相關性較好（r均=0.70，P＜0.0001），血清HBsAg水平與cccDNA的相關性較弱（r=0.40，P＜0.0001）［11］。作者認為，血清HBV DNA并不能完全真實地反映HBV cccDNA表達水平。理論上認為HBsAg是反映HBV活性和肝內HBV cccDNA水平的血清生物學標志物，但對于采用核苷（酸）類似物治療的CHB患者，即使HBV DNA低于檢測下線后但HBsAg水平仍可檢出且可高表達，在肝內HBV cccDNA還可檢出或高表達，提示HBsAg與cccDNA的相關性較弱［12］，這可能與HBV復制的低水平或存在與循環(huán)血中空HBsAg顆粒的高表達相關，進一步研究也顯示HBsAg與HBV cccDNA的相關性較差。作者認為，血清HB‐sAg與HBV cccDNA相關性相對性較差而不是一個理想反映HBV cccDNA水平的替代生物學指標，而循環(huán)血中的HBcrAg表達水平可較好地反映HBV cccDNA存在狀態(tài)與復制水平。

2.2 預測HBV相關性肝臟疾病患者HBeAg血清學轉換HBV感染后獲得免疫調控的結果之一是由HBeAg（+）轉化為HBeAg（-），即血清學轉換，一旦發(fā)生HBeAg（-）變化，提示HBV感染的相關疾病患者發(fā)生HCC風險可能性下調。部分HBV感染的相關疾病患者，未經抗HBV治療也能出現HBeAg血清學轉換，但多數HBV感染的相關肝病患者還是需抗HBV治療后才能呈現HBeAg的血清學轉換。

觀察HBV感染的相關肝病患者血清HBcrAg水平表達對患者病情與病程監(jiān)測有指導作用［9］。有研究結果顯示，HBeAg（+）慢性肝炎或慢性感染者循環(huán)血清HBcrAg表達水平較HBeAg（-）的CHB或慢性感染者高表達，提示HBcrAg表達水平與HBeAg的表達模式有明顯的相關性，作者認為，患者血清HB‐crAg可在一定程度上區(qū)分CHB/慢性感染者HBeAg的表達模式［13-15］。研究發(fā)現，對HBeAg（+）CHB患者行6個月的PEG-IFN治療后發(fā)現，有9例患者在停用IFNα治療后的隨訪中出現HBeAg血清學轉換，其循環(huán)血清HBcrAg水平在治療結束后仍持續(xù)性下調，但循環(huán)血清HBsAg水平下調持續(xù)時間短、下調幅度不明顯［7］，另外，在PEG-IFNα治療1個月時循環(huán)血清中HBcrAg水平下調幅度可較好預測治療停藥時的HBeAg血清學轉換的發(fā)生概率。研究發(fā)現，血清HBcrAg可有效預測CHB患者抗HBV治療后的HBeAg血清學轉換概率［8］。

2.3 判斷HBV相關性肝臟疾病臨床治愈的終點HBsAg是HBV顆粒的外膜蛋白，HBV復制是以肝細胞核中HBV cccDNA為模板合成新的HBV基因，同時參與HBV復制、轉錄所需蛋白的合成。在HBV基因組中S、preS1和preS2區(qū)合成了小、中、大3種分子的蛋白質并構成HBV顆粒的包膜，小、中、大3種分子的蛋白質通過形成完整病毒顆粒（Dane顆粒）或管狀或球狀亞病毒顆粒模式分泌出來，即循環(huán)血清中的HBsAg蛋白質，在免疫抑制中發(fā)揮誘導作用而使HBV存在于體內、并不斷感染新的肝細胞［16］，其高水平的HBsAg為診斷HBV感染的生物學標志物之一［17］。

研究發(fā)現，在抗HBV治療中，HBsAg（-）提示其為抗HBV治療終點的生物學指標之一，治療結束后患者復發(fā)率較低［18］，在對CHB患者抗HBV治療中出現HBsAg（-），停藥40.2個月后的隨訪中出現復發(fā)的占4.5%［19］。接受恩替卡韋（ETV）治療的CHB患者在達到停藥標準后再鞏固治療1年及以上，在停藥 后6、12和24個 月 時，28例HBsAg水平＞3 lgIU/mL的CHB患者停藥后復發(fā)率為15.4%、55.7%和83.4%［20］；11例HBsAg水 平 為＞2～3 lgIU/mL的CHB患者停藥時復發(fā)率為18.2%、28.4%和28.4%，該研究結果顯示，HBsAg的血清學轉換與表達是CHB患者抗HBV治療終點的標志物之一，對CHB患者抗HBV治療終點時機選擇與復發(fā)預測有一定的指導作用。研究發(fā)現，CHB患者血清HBsAg表達水平與肝組織內HBV cccDNA的相關性弱，這可能與部分CHB患者血清HBsAg（-）而其肝組織中HBV cccDNA仍表達相關［8］，與部分學者研究的血清HBsAg水平與肝組織內HBV cccD‐NA無明顯相關性的結果相一致，提示血清HBsAg水平不能完全反映肝組織內HBV cccDNA的水平。另外，HBV cccDNA在被清除或沉默時，其血清HB‐sAg仍可低水平表達，這可能與HBsAg蛋白合成多途徑相關，同時血清中HBsAg多在無HBV DNA表達的小球型、管狀顆粒中表達，但也可表達于Dane顆粒包膜上，HBsAg主要在小球型、管狀顆粒中表達，血清中HBsAg多來自肝細胞核內HBV cccD‐NA，提示整合的HBV DNA片段也可轉錄HB‐sAg［21-22］。作者認為，以HBsAg表達水平或血清學轉化來作為CHB臨床治愈的判斷終點存在一定的局限性，如聯合血清HBcrAg水平來共同判斷抗HBV治療CHB患者臨床治療終點及停藥后復發(fā)風險可能意義更大。

2.4 選擇抗HBV治療停藥時機、預測HBV是否復發(fā)目前關于CHB患者抗HBV治療公認的治療終點是HBsAg消失或血清學轉換，在臨床治療過程中要達到此標準較為困難。對于部分HBsAg（+）的CHB患者，會因各種原因需考慮停藥，但停藥后存在HBV復制或再復制、肝組織炎癥發(fā)生及肝細胞惡變等問題。目前認為CHB患者停用抗HBV藥物后能否再出現HBV復制、肝組織炎癥或肝細胞惡變的發(fā)生多與肝細胞內HBV cccDNA水平表達和患者機體對HBV特異性免疫清除能力這兩個因素有關。

殘存于肝細胞中HBV cccDNA的復制能力與其HBV水平、誘發(fā)因素、HBV復制的微環(huán)境形成及患者機體對HBV特異性免疫清除能力等因素相關。在機體誘發(fā)因素和HBV復制微環(huán)境等相對穩(wěn)定狀態(tài)下，HBV cccDNA水平取決于HBV cccDNA的復制能力，為此了解肝組織內HBV cccDNA水平表達有利于抗HBV治療終止時機選擇及預測停藥后HBV再復制、肝組織炎癥再發(fā)生或肝細胞惡變的重要生物學指標。多數學者認為血清HBcrAg是反映肝內HBV cccDNA水平的較好替代血清生物學指標，其相關性與準確性優(yōu)于血清HBV RNA和HB‐sAg水平，為此作者認為，血清HBcrAg可能是預測抗HBV治療停藥后是否復發(fā)的有效評估指標之一。

在日本的CHB診治指南中已將血清HBcrAg定量檢測推薦用于CHB患者抗HBV治療停藥時機選擇及病情復發(fā)評估的重要預測指標。研究發(fā)現，對于CHB患者在采用核苷（酸）類似物抗HBV治療2年以上時，在血清HBV DNA和HBeAg均（-）的條件下停藥與否還需通過HBcrAg和HBsAg水平評分來綜合預測、評估停藥后的復發(fā)風險［23］。在該評分系統(tǒng)中，停藥時需按血清HBcrAg水平高低評分，0分為HBcrAg＜3.0 logU/mL、1分 為HBcrAg在3.0～4.0 logU/mL間，2分為HBcrAg≥4.0 log U/mL。根據血清HBcrAg水平與評分總和將CHB患者停藥后復發(fā)風險分為3級，高風險組為3～4分，中風險組為1～2分，低風險組為0分。研究發(fā)現，低風險組停藥后復發(fā)風險率為10%～20%，可考慮停藥，但需警惕有復發(fā)風險，中風險組停藥后復發(fā)風險率約50%，高風險組停藥后復發(fā)風險率為80%～90%，對于中、高風險組患者建議持續(xù)治療，不宜停用抗HBV治療。

研究發(fā)現，對于血清HBsAg低水平的CHB患者其血清HBcrAg水平可出現高表達；同樣血清HBcrAg＜3 logU/mL的CHB患者其血清HBsAg水平也可出現高表達，為此，作者認為，僅據血清HBsAg或血清HBcrAg表達水平來選擇抗HBV治療的停藥時機或治療終點可能存在一定局限性。有研究發(fā)現，在對CHB患者采用核苷（酸）類似物抗HBV治療8年以上的研究結果顯示，其循環(huán)血中HBsAg和HBcrAg表達水平與抗HBV治療時間的延長呈正相關系，也就是說CHB患者血清HBsAg和HBcrAg表達水平在隨抗HBV治療時間的延長其水平呈現明顯下調趨勢［24-25］。據血清HBcrAg水平對CHB患者抗HBV治療停藥后復發(fā)風險評估發(fā)現，低、中、高風險組的復發(fā)風險分別為3.2%、34.0%和62.8%，這可能是血清HBsAg低水平或HBsAg血清學轉換后的CHB患者在停用抗HBV治療后短期內復發(fā)的原因，若同時檢測血清HBcrAg水平可能有助于避免盲目或因過早過遲停藥后不良現象的出現［26］。

2.5 預測HBV相關性肝臟疾病患者發(fā)生肝細胞癌變的概率HCC的發(fā)生與肝細胞受到持續(xù)與反復的炎癥刺激或HBV基因整合后的基因突變等因素相關，同時持續(xù)的HBV cccDNA存在或高表達是HCC發(fā)生的高危因素。在HCC患者中，其血清HB‐crAg與HBV cccDNA相關性較強，為此，作者認為CHB患者血清HBcrAg過表達可能與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關。

為了解血清HBcrAg水平與HCC發(fā)生發(fā)展的相關性，有研究發(fā)現，血清HBcrAg在預測HCC發(fā)生方面優(yōu)于血清HBV DNA和HBeAg，其HBcrAg水平持續(xù)＞2.9 logU/mL是HCC發(fā)生的獨立預測因子［27］。有研究結果顯示，在對CHB患者采用核苷（酸）類似物治療后HBV DNA水平低于檢測下線時，與未發(fā)生HCC的CHB患者比較，治療前HCC患者HBcrAg水平高表達（5.45 logU/mL和4.55 logU/mL，P=0.005）；其治療前HBcrAg＞4.67 logU/mL和治療后HBcrAg＞3.89 log U/mL均 可 獨 立 預 測HCC的 發(fā)生［28］。另外，血清HBcrAg對HCC切除或射頻消融后的復發(fā)具有一定的預測價值。研究發(fā)現，對HBV相關性HCC患者行根治性切除或經皮消融術后再采用核苷（酸）類似物抗HBV治療的研究發(fā)現，若血清HBcrAg＞4.8 logU/mL在2年內HCC復發(fā)危險比為8.96［29］。此外，在對HBV相關性HCC患者采用核苷（酸）類似物抗HBV治療后，其血清中HBcrAg持續(xù)高表達者更易發(fā)展為HCC，HBeAg（-）后3年內有HBcrAg過表達是HCC發(fā)生發(fā)展的獨立相關因素［30］。研究發(fā)現，核苷（酸）類似物治療CHB患者后血清HBcrAg＞3.01gU/mL時，發(fā)生HCC的風險較高（HR=2.77），提示高水平血清HBcrAg與HCC發(fā)生顯著相關（HR=3.53），多變量分析發(fā)現，CHB患者血清HBcrAg＞2.91gU/mL（HR=5.09，95%可 信 區(qū) 間2.40～10.63）與HCC的發(fā)生顯著相關［31］。為此，作者認為，在預測CHB患者HCC發(fā)生風險方面，HB‐crAg較HBV DNA等血清學標志物優(yōu)勢較為顯著，提示血清HBcrAg可能成為預測HBV相關性肝病患者HCC發(fā)生的可能潛在生物學標志物之一。作者認為，血清HBcrAg在預測HCC發(fā)生、腫瘤復發(fā)及抗HBV療效評價方面體現出明顯的臨床價值，盡可能將血清HBcrAg控制在最低水平以最大限度降低HBV水平對抑制HBV復發(fā)或降低HCC發(fā)生及術后HCC復發(fā)風險具有一定的潛在價值。

綜上所述，HBcrAg、HBV RNA等一些新的潛在生物學指標能在一定程度上可預測肝內cccDNA的存在與轉錄狀態(tài)、預測HBV相關性肝臟疾病HBeAg血清學轉換、反映HBV RNA、HBV DNA、HBsAg水平，同時在預測CHB患者病情狀況、評估療效、選擇停藥時機及預測停藥后復發(fā)風險等方面具有較高的臨床價值。但目前血清HBcrAg檢測技術尚未成熟，仍處于探索階段，如血清HBcrAg是否能準確地反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)，HBcrAg作為停藥終點指標的價值是否優(yōu)于HBsAg等問題尚待解決。