郝 燕，李金霞，孫小妹，陳年來

沼液對河西綠洲葡萄園土壤微生物功能多樣性的影響①

郝 燕，李金霞，孫小妹，陳年來*

(甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，蘭州 730070)

在甘肅祁連葡萄觀光園進行了增施沼液試驗，旨在探明沼液施用量和年限對土壤質量和土壤微生物功能多樣性的影響，試驗設置的處理包括：對照處理(施用化肥，N 180 kg/hm2，P2O5150 kg/hm2，K2O 22.5 kg/hm2)、沼液替代化肥處理(33%、67% 和100% 化肥氮分別被沼液氮替代)及沼液增施處理(沼液氮用量分別為化肥氮的133%、167% 和200%)，采用Biolog-ECO微平板法測定土壤微生物功能多樣性。結果表明：①33% 沼液處理的土壤微生物群落代謝活性最高，連續(xù)2 a使用沼液的處理間差異大于1 a使用。②土壤微生物利用的主要碳源為碳水化合物類，使用沼液能夠顯著提高土壤微生物對氨基酸類和羧酸類碳源的利用率。連續(xù)兩年使用沼液，133% 和167% 沼液處理的效果優(yōu)于其他處理。③與對照相比，使用沼液處理僅在提高土壤微生物均一度指數方面存在優(yōu)勢，且133% 和167% 沼液處理效果優(yōu)于其他處理。④主成分分析表明，沼液使用量和使用年限對土壤微生物碳源利用水平以及代謝多樣性的影響有差異，且使用年限增加能使各處理間變異程度增大。⑤碳水化合物類和氨基酸類碳源是引起不同沼液處理土壤微生物功能群分異的主要碳源，其中碳水化合物類是沼液使用年限增加后土壤微生物群落變化的敏感碳源。⑥Pearson相關性分析表明，土壤微生物功能多樣性與土壤有機質、堿解氮含量呈正相關關系，與有效磷、速效鉀含量呈負相關關系。綜上，長期使用沼液(尤其是沼液與化肥配施)有利于提高土壤微生物代謝活性和土壤微生物群落功能多樣性，且當沼液使用量較大時可以完全取代化肥。

沼液；使用年限；Biolog-ECO微平板法；土壤微生物功能多樣性

隨著鄉(xiāng)村畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽糞便的產生量增長加快，已占農業(yè)有機廢棄物的2/5以上[1]，超過220億t的年固廢產量使畜禽養(yǎng)殖業(yè)成為僅次于造紙廢水污染的社會公害。據推算，2020年我國畜禽糞便的產生量將達到28.75億t，其中羊糞占比13.25%、豬糞占比19.59%、牛糞占比33.85%；2030年我國畜禽糞便的產生量將進一步提高到37.43億t，羊糞、豬糞、牛糞的占比將分別達到15.08%、15.71%、44.61%[2]。畜禽糞便的大量產生對我國生態(tài)環(huán)境造成嚴重威脅，其中牛糞占比最大，增長幅度較快，因此如何有效、充分利用牛糞成為畜禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的首要問題。

沼液是作物秸稈和人畜糞便等原料經過沼氣池厭氧發(fā)酵制取沼氣后的有機殘留物，是畜禽糞便資源化利用的直接途徑。厭氧發(fā)酵后產生的沼液除碳素損失較大外，90% 的營養(yǎng)成分仍得以保持，是一種速效有機液體肥料[3]。大量研究表明，沼液可以改善農田土壤肥力[4-5]、提高農產品產量和品質[6-7]、預防和控制作物病害[8]，增加土壤微生物生物量碳氮含量[9]。因此，以畜禽糞便為原料的沼液應用于作物生產既可以節(jié)約化肥的使用量，減輕其對環(huán)境的污染，又能解決養(yǎng)殖業(yè)產生的糞污問題。

Galvez等[10]研究發(fā)現(xiàn)適量的沼液可以改善土壤質量，使土壤中各類營養(yǎng)元素更加均衡；Abubaker等[11]研究發(fā)現(xiàn)合理使用沼液可以提高小麥產量和品質；Terhoeven-Urselmans等[12]研究發(fā)現(xiàn)沼液農用可以進一步提高土壤酶活性。目前關于沼液還田的研究主要集中在土壤質量、作物產量和品質、土壤酶活性等方面，但關于以牛糞為原料的沼液在農作物上的應用，尤其是沼液化肥配施以及使用年限對作物根際土壤微生物功能多樣性的研究鮮有報道。

土壤微生物功能多樣性是衡量土壤質量和健康狀況的重要生物學指標，能夠反映土壤微生物群落組成和結構變化[13-14]。隨著土壤微生物研究方法的進步與革新，許多高新技術被應用于土壤微生物功能多樣性的研究，目前使用較多的是Biolog法。Biolog法是一種通過測定土壤微生物對不同碳源利用能力及其代謝差異，進而用以表征土壤微生物功能多樣性的方法，因其具有簡便、靈敏、迅速等優(yōu)點而被廣泛地使用[15]。

因此，本文以牛糞發(fā)酵的沼液為原料，通過連續(xù)2 a大田試驗研究沼液替代與增施對土壤微生物功能多樣性的影響，旨在探討土壤微生物群落結構對沼液使用量和使用年限的響應，為綠洲農田土壤質量改善和沼液資源化利用提供理論依據和科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2017年5月至2018年8月在甘肅省高臺縣祁連葡萄觀光園內進行。該試驗區(qū)屬大陸性干旱荒漠草原氣候，年均日照時數3 118 h，無霜期150 d，年均氣溫7.5 ℃，極端最高氣溫38.7 ℃，極端最低氣溫–31 ℃，晝夜溫差大，園區(qū)海拔1 359 m。土壤為風沙土，0 ~ 20 cm土層有機質含量10.96 g/kg，堿解氮含量52.73 mg/kg，有效磷含量20.14 mg/kg，速效鉀含量138.67 mg/kg，pH為7.32。

1.2 試驗材料

供試葡萄品種為紅巴拉多，4 a生，小棚架栽培，獨龍干形整枝，種植行距4 m，株距0.9 m，密度2 775株/hm2。

供試沼液為牛糞經正常厭氧發(fā)酵產生沼氣后固液分離的原沼液，采自甘肅省高臺縣方正節(jié)能科技服務有限公司。該原液含有機質55.6 g/L、全氮2.6 g/L、全磷0.12 g/L、全鉀3.6 g/L、速效氮1.4 g/L、速效磷0.04 g/L、速效鉀2.2 g/L。

1.3 試驗設計

田間試驗采用裂區(qū)設計，主區(qū)為沼肥使用年限，設1 a和2 a兩個處理；副區(qū)為沼液用量，設置沼液替代(利用沼液替代化學肥料中33%、67% 和100% 氮素)和沼液增施(沼液氮用量相當于對照氮素用量的133%、167% 和200%)2組處理。經換算，沼液替代組沼液用量為35 775、72 675、100 530 kg/hm2，沼液增施組沼液用量為133 650、167 805、198 090 kg/hm2。以傳統(tǒng)施肥(化肥配施，折純養(yǎng)分量為N 180 kg/hm2、P2O5150 kg/hm2、K2O 22.5 kg/hm2)為對照，每個處理3次重復，共39個小區(qū)，小區(qū)面積為72 m2。

沼液使用時間與當地習慣施肥相同，即第一次5月上旬，第二次6月中旬，第三次7月中旬。試驗期間葡萄園整枝、除草、疏穗、病蟲害防治等農事操作按常規(guī)方式進行。

1.4 土壤樣品采集及處理

土壤取樣時間為 2018年7月中旬。為使土樣具有代表性，采用五點法分別在每個小區(qū)隨機選5個點，每個點在距葡萄主根15 cm處，分別采集0 ~ 20 cm土層樣品，混合均勻，快速剔除植物殘體后放入冰盒并及時運回實驗室，置于冷凍冰箱(溫度控制在4 ℃)保存用于測定土壤微生物功能多樣性。

1.5 土壤理化性質測定

土壤pH采用電位法測定，土壤有機質(SOM)采用重鉻酸鉀–外加熱法測定，堿解氮(AN)采用堿解擴散法測定，有效磷(AP)采用碳酸氫鈉浸提–鉬銻抗比色法測定，速效鉀(AK)采用NH4OAc浸提–火焰光度法測定[16]。

1.6 土壤微生物功能多樣性測定

土壤微生物功能多樣性采用Biolog-ECO微平板(BIOLOG EcoPlatesTM) 法測定[17]。在超凈工作臺中稱取10 g土樣于250 ml滅菌三角瓶中，加入90 ml濃度為0.85 g/ml的NaCl溶液后封口，振蕩1 h(220 r/min)，靜置30 min，吸取5 ml上清液于裝有45 ml濃度為0.85 g/ml NaCl溶液的三角瓶中，振蕩30 min(220 r/min)后備用。用Biolog系統(tǒng)自帶加樣器將其接種到培養(yǎng)板上，每個微孔150 μl，每樣1板，3次重復，之后放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)240 h。每隔24 h用Biolog配套讀數器分別讀取ECO培養(yǎng)板在590 nm(顏色+濁度)和750 nm(濁度)波長下的吸光值。

通過計算平均顏色變化率(average well color development，AWCD)來反映土壤微生物整體活性，并通過計算Shannon-Wiener多樣性指數()、McIntosh均一度指數()、Simpson優(yōu)勢度指數()以及碳源豐富度指數()來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性[18]。

AWCD作為反映土壤微生物群落利用單一碳源的重要指標，其隨著培養(yǎng)時間的變化曲線可以揭示土壤微生物群落的代謝強度。計算公式如下：

式中：C為各反應孔在590 nm和750 nm下的吸光值之差；為對照孔在590 nm和750 nm下的吸光值之差；C–<0時記為0。

Shannon-Wiener多樣性指數()：

式中：P為第孔的相對吸光值與微平板所有相對吸光值總和之比(下同)，計算公式如下：

McIntosh指數()：

式中：n為第孔的相對吸光值(n=C–)。

Simpson優(yōu)勢度指數()：

碳源利用豐富度指數()：

=被利用碳源總數(相對吸光值>0.200的反應孔數目) (6)

1.7 數據處理

本文數據均用3次重復的平均值表示。數據經Excel 2018軟件整理后，運用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析、主成分分析和Pearson相關性分析，差異顯著性分析采用Duncan新復極差法，顯著性水平<0.05。

2 結果與分析

2.1 沼液使用量對土壤微生物整體代謝活性的影響

各處理土壤樣品AWCD值均隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)類似logestic的增長態(tài)勢(圖1)。0 ~ 24 h(緩慢期)各樣品AWCD值無明顯變化，24 ~ 96 h(對數期)AWCD值快速升高，96 ~ 168h(減速期)上升速度減緩，168 ~ 240 h(穩(wěn)定期)曲線基本平穩(wěn)(圖1)。

使用沼液1 a時，在對數期，133% 沼液處理AWCD值最大，100% 沼液處理AWCD值最??；在減速期至穩(wěn)定期，67%、100%、200% 沼液處理間AWCD值出現(xiàn)明顯差異，其余處理AWCD曲線發(fā)生重合。使用沼液2 a時，各處理間AWCD值差異于對數期開始顯現(xiàn)，33% 沼液處理AWCD值最大，單施化肥的CK處理次之，67%、167%、200% 沼液處理居中，133%、100% 沼液處理最??；在減速期，67%、167%、200% 沼液處理AWCD曲線出現(xiàn)交叉現(xiàn)象；在穩(wěn)定期，67% 沼液處理AWCD值上升速度減緩，與其他處理差異明顯，167%、200% 沼液處理AWCD曲線基本重合。

對比沼液使用不同年限土壤樣品AWCD變化曲線發(fā)現(xiàn)，33% 沼液處理土壤微生物代謝活性始終較高，100% 沼液處理土壤微生物代謝活性始終最低。使用沼液2 a的土壤樣品AWCD平均值(0.584)略低于使用沼液1 a土壤樣品(0.631)，但各處理間差異較第1年更明顯。

(圖例中CK為單施化肥處理，33%、67%、100% 分別表示沼液替代33%、67%、100% 化肥氮量處理，133%、167%、200% 分別表示沼液氮用量為化肥氮的133%、167%、200% 處理；下同)

2.2 沼液使用量對土壤微生物群落碳源利用強度的影響

總體來看，試驗區(qū)土壤微生物利用的主要碳源是碳水化合物類，其次是氨基酸類、聚合物類、羧酸類，分別占總碳源利用量的41.36%、20.41%、14.68%、14.16%，對酚酸類和胺類碳源的利用率不足總碳源的10%(圖2)。使用沼液能夠明顯提高土壤微生物對除碳水化合物外其他碳源的利用能力，使用沼液1a時的提高幅度大于使用沼液2 a時(圖2)。

使用沼液1 a時，200% 沼液處理土壤微生物對碳水化合物類碳源利用率與CK間無顯著差異，其余沼液處理均使土壤微生物對其他碳源的利用率提高，其中67% 沼液處理對氨基酸類碳源的利用率最高，比CK顯著提高34.0%；33% 和167% 沼液處理對羧酸類碳源利用率最高，分別比CK顯著提高46.7% 和38.1%；對聚合物類、酚酸類、胺類碳源利用率最高的是67%、133%、67% 沼液處理，與CK相比分別提高7.1%、103.4%、70.2%，但無顯著差異。

使用沼液2 a時，各沼液處理使土壤微生物對除碳水化合物外其他碳源的利用率均有所提高，其中，33% 和133% 沼液處理使土壤微生物對氨基酸類和羧酸類碳源的利用率顯著提高12.8%、33.2% 和41.8%、22.9%，其余處理碳源利用率與CK無顯著差異。對聚合物類、酚酸類、胺類碳源利用率最高的是100%、167%、133% 沼液處理，與CK相比分別提高13.8%、40.5%、48.2%，但無顯著差異。

綜上，使用沼液能顯著提高氨基酸類和羧酸類碳源的利用率，同時酚酸類和胺類碳源的利用率也得到大幅度提高，說明使用沼液改變了土壤微生物的適宜性，從而影響其對碳源的選擇性利用。

2.3 沼液使用量對土壤微生物群落功能多樣性的影響

沼液用量對供試葡萄園土壤微生物McIntosh均一度指數U產生明顯影響，但對Shannon-Wiener多樣性指數H′、碳源豐富度指數和Simpon優(yōu)勢度指數影響不大(表1)，連續(xù)2 a使用沼液，100% 沼液處理的McIntosh均一度指數顯著低于33% 沼液處理。無論是Shannon-Wiener多樣性指數和McIntosh均一度指數，還是Simpon優(yōu)勢度指數和碳源豐富度指數均為100% 沼液處理最低，說明沼液完全替代化肥遠不如沼液化肥配施亦或使用高量沼液效果理想。

2.4 土壤微生物群落功能主成分分析

根據主成分分析法(PCA)，在使用沼液1 a和2 a試驗樣品中各自提取9個主成分(特征根>1)，累積貢獻率分別達84.38% 和86.44%，第1主成分(PC1)貢獻率分別是25.12% 和35.12%，第2主成分(PC2)貢獻率分別是14.45% 和10.93%。因第3至第9主成分方差貢獻率較小，本文選取第1主成分和第2主成分作圖來表征土壤微生物群落碳源代謝特征(圖3)。

使用沼液1 a時，133%、200% 沼液處理主要分布在第二象限，100% 沼液處理主要分布在第三象限，33%、67% 和167% 沼液處理主要分布在第四象限，CK(單施化肥)主要分布在PC1和PC2軸上，表明133%、200% 沼液處理碳源利用方式相似，33%、67% 和167% 沼液處理碳源利用方式相似，而單施化肥、100% 沼液處理與上述兩類土壤微生物群落代謝結構存在明顯差異。

(圖中不同小寫字母表示同一年限下各處理間差異顯著(P<0.05)，ns表示差異不顯著；下同)

表1 不同沼液處理下土壤微生物群落功能多樣性指數變化

注：表中同列不同小寫字母表示處理間差異在<0.05水平顯著。

使用沼液2 a時，33%、167% 沼液處理主要分布在第一象限，200% 沼液處理主要分布在第二象限，67% 沼液處理主要分布在第三象限，CK、100%、133% 沼液處理主要分布在第四象限，表明33%、167%沼液處理碳源利用方式相似，CK、100% 和133% 沼液處理碳源利用方式相似，而67%、200% 沼液處理與上述兩類土壤微生物群落代謝結構具有明顯差異。此外，可以推測沼液和化肥對土壤微生物群落代謝存在交互影響，但沼液對土壤微生物群落代謝結構的影響更大，這可能與使用沼液后土壤養(yǎng)分發(fā)生變化有關。

使用沼液1 a時，決定PC1變異的碳源主要有13種，其中碳水化合物1種(D-甘露醇)，羧酸2種(γ-羥丁酸、衣康酸)，氨基酸4種(L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-絲氨酸、L-蘇氨酸)，聚合物2種(吐溫40、吐溫80)，酚酸2種(2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸)，胺2種(苯乙胺、腐胺)；決定PC2變異的碳源主要有5種，其中碳水化合物4種(D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-半乳糖酸-γ-內脂)，胺1種(腐胺)(表2)。

圖3 不同沼液處理下土壤微生物群落功能主成分分析

使用沼液2 a時，決定PC1變異的碳源主要有22種，其中碳水化合物8種(D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸-γ-內脂)，羧酸3種(丙酮酸甲酯、衣康酸、D-蘋果酸)，氨基酸4種(L-天門冬酰胺、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸)，聚合物3種(吐溫40、α-環(huán)式糊精、肝糖)，酚酸2種(2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸)，胺2種(苯乙胺、腐胺)；決定PC2變異的碳源主要有5種，其中碳水化合物2種(D-葡萄糖胺酸、D-半乳糖醛酸)，羧酸1種(γ-羥丁酸)，氨基酸2種(L-精氨酸、L-天門冬酰胺)(表2)。

表2 31種碳源在第1、2主成分上的載荷值

結合表2可以發(fā)現(xiàn)，使用沼液2a顯著提高了7種碳水化合物(D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸-γ-內脂)、2種羧酸(丙酮酸甲酯、D-蘋果酸)、2種氨基酸(L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸)和2種聚合物(α-環(huán)式糊精、肝糖)等共13種碳源的代謝能力。

2.5 土壤微生物功能多樣性與土壤理化性質相關性

將土壤微生物功能多樣性指數與土壤pH、有機質以及速效養(yǎng)分進行相關性分析，由表3可以看出，使用沼液1 a時，McIntosh均一度指數與有效磷含量呈顯著負相關(<0.05)；碳源豐富度指數與pH呈顯著正相關(<0.05)；Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson優(yōu)勢度指數與土壤理化因子間的相關性系數不顯著。使用沼液2a時，Shannon-Wiener多樣性指數與有機質含量呈顯著正相關(<0.05)，與堿解氮含量呈極顯著正相關(<0.01)；McIntosh均一度指數與pH、速效鉀含量呈顯著負相關(<0.05)，與有機質含量呈顯著正相關(<0.05)；Simpson優(yōu)勢度指數與有機質含量呈顯著正相關(<0.05)，與堿解氮含量呈極顯著正相關(<0.01)；碳源豐富度指數與有機質、堿解氮含量呈極顯著正相關(<0.01)。因此，該試驗地土壤微生物功能多樣性與土壤有機質、堿解氮含量呈正相關關系，與有效磷、速效鉀含量呈負相關關系。

表3 微生物群落功能多樣性指數與土壤理化性質相關性

注：*表示顯著相關(<0.05)；**表示極顯著相關(<0.01)。

3 討論

3.1 沼液使用量對土壤微生物整體代謝活性的影響

通常細菌板在590 nm波長下讀數表征顏色變化，真菌板在750 nm波長下讀數表征濁度變化，由于細菌板(26 ~ 37℃)和真菌板(26℃)培養(yǎng)溫度相近[19-20]，故本文采用雙波長檢測，用590 nm與750 nm吸光值之差來表征細菌板的顏色變化，可以排除氣泡、真菌引起的濁度變化等干擾。

平均顏色變化率(AWCD)能夠有效反映土壤微生物群落利用碳源的能力(整體代謝活性)，AWCD值越大，表明土壤微生物整體代謝活性越高[21]。唐海明等[22]研究發(fā)現(xiàn)有機肥與化肥配施能顯著提高土壤微生物利用碳源的整體能力，使土壤微生物的代謝活性得到顯著增強。本研究發(fā)現(xiàn)，33% 沼液處理的土壤微生物代謝活性最高，可能是因為該替代比例可以極大改善土壤微生物群落的營養(yǎng)供應，進而提高土壤微生物群落代謝能力。經過2 a沼液使用，100% 沼液處理土壤微生物代謝活性始終最低(與對照差異顯著)，說明沼液完全替代化肥(等氮量)會顯著降低土壤微生物群落整體代謝活性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，除33%、200% 沼液處理土壤微生物代謝活性于2 a后略有提高外，其余處理土壤微生物代謝活性均降低，這與李娟等[23]、孫瑞蓮等[24]研究結果不一致，可能是因為長期使用沼液有利于植物根系的生長，而植物根系與土壤微生物競爭養(yǎng)分，以致根系分泌大量化學物質抑制土壤微生物的活性[25-26]。

3.2 沼液使用量對土壤微生物群落利用強度的影響

有機氮是土壤中有效氮的源和庫，氨基酸類物質是有機氮的重要組成部分，土壤微生物可利用氨基酸合成植物生長調節(jié)劑以促進植物生長[27]。此外，氨基酸類物質對有機質有正激發(fā)效應，能夠加快土壤有機質的分解，降低土壤中有機質的含量[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用沼液2 a各處理對氨基酸類碳源的利用率均顯著提高，這是因為長期使用沼液使得碳源趨于穩(wěn)定，促進了以氨基酸類物質為碳源的微生物群落的發(fā)育，能夠加速土壤中有機質的分解。

酚酸類物質含量過高是農作物產生自毒作用的主要原因，前人研究表明使用有機肥能夠降低土壤中酚酸類物質的含量[29]。也有研究發(fā)現(xiàn)，使用生物有機肥可顯著提高微生物對酚酸類碳源的利用能力[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，增施氮量處理(133%、167% 沼液處理)能夠大量消耗土壤中的酚酸類物質，降低其在土壤中的積累，從而在一定程度上抑制有害微生物的繁殖，對減輕葡萄連作障礙有積極作用。

3.3 沼液使用量對土壤微生物群落功能多樣性的影響

土壤微生物群落是土壤生態(tài)功能的基礎，一般來說，使用沼液能夠提高土壤微生物功能多樣性指數[31-32]，但本研究發(fā)現(xiàn)，除McIntosh均一度指數外，各沼液處理的土壤微生物Shannon-Wiener多樣性指數和碳源豐富度指數均低于單施化肥對照，可能是因為使用沼液能提高葡萄植株獲取土壤養(yǎng)分的能力，抑制土壤微生物的生長繁殖，以致土壤微生物多樣性明顯降低[33]。本研究還發(fā)現(xiàn)，單施化肥處理Shannon-Wiener多樣性指數較高，而McIntosh均一度指數較低，這可能是因為長時間使用化肥極大促進了某些微生物種群的生長代謝，而他種微生物種群的生長代謝被抑制，以致單施化肥處理下土壤微生物種類增加而均勻度下降[34]。此外不同沼液使用年限土壤微生物多樣性對沼液使用量的響應不一致，說明沼液使用年限也是影響微生物多樣性的一個重要因子，可能是土壤間養(yǎng)分含量差異導致。

3.4 土壤微生物群落功能主成分分析

主成分分析表明，不同沼液用量處理土壤微生物群落在碳源利用上存在較大差異，長期使用沼液加劇了各處理間的變異程度，增加了根際土壤微生物群落的變異性。這可能是因為沼液中豐富的營養(yǎng)成分使得土壤有機物質的含量和組成發(fā)生變化，導致土壤中可提供的碳源種類及含量發(fā)生變化，區(qū)分了不同碳源微生物，最終產生了微生物功能多樣性。此外，使用沼液2 a較使用沼液1 a土壤微生物群落離散度大，這是因為土壤微生物短期內會維持相對穩(wěn)定，只有長期使用沼液才會使土壤微生物區(qū)系結構發(fā)生變化，使用年限間差異主要是由碳水化合物類碳源引起。

3.5 土壤微生物功能多樣性與土壤養(yǎng)分的關系

土壤養(yǎng)分含量的高低對微生物功能多樣性有重要影響[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機質和速效養(yǎng)分是影響土壤微生物功能多樣性的重要因子。土壤微生物功能多樣性與土壤有機質、堿解氮含量呈正相關，與有效磷、速效鉀含量呈負相關，這與郝曉暉等[36]、Dalmonech等[37]研究結果一致。鐘芳等[38]研究得出土壤微生物功能多樣性與速效鉀含量呈顯著正相關，與本研究結果不一致，可能與本試驗地土壤鉀元素較豐富有關。

本試驗僅針對連續(xù)使用2 a沼液的土壤微生物群落代謝活性及多樣性進行研究，結果表明沼液和化肥配施有利于提高土壤微生物代謝活性和土壤微生物群落功能多樣性，且當沼液使用量較大時能達到完全取代化肥的效果。而關于長期沼液農用對土壤微生物群落活性和多樣性的影響以及是否對土壤質量帶來負面影響等方面有待進一步研究。

4 結論

1)沼液替代100% 化肥氮處理對土壤微生物群落代謝活性影響最小，沼液替代33% 化肥氮處理對土壤微生物群落代謝活性影響最大。

2)供試葡萄園土壤微生物主要利用碳水化合物類碳源，其次是氨基酸類碳源。使用沼液能夠改變土壤微生物的代謝結構，顯著提高土壤微生物對氨基酸類、羧酸類碳源的利用能力，且隨沼液使用年限增加，增施氮量處理(133%、167% 沼液處理)在提高土壤微生物碳源利用能力方面較沼液部分替代化肥氮處理更具優(yōu)勢。

3)各施肥處理土壤微生物Simpson優(yōu)勢度指數變化不明顯，Shannon-Wiener多樣性指數、McIntosh均一度指數和碳源豐富度指數均以沼液替代100% 化肥氮處理最低。與單施化肥的對照相比，使用沼液處理僅在提高土壤微生物McIntosh均一度指數方面存在優(yōu)勢，增施氮量處理提高效果較好，能使土壤生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定。

4)結合主成分分析得出，沼液處理下土壤微生物群落被劃分為3 ~ 4個功能群，碳水化合物類、氨基酸類是引起微生物類群分異的主要碳源，其中碳水化合物類是沼液使用年限增加后土壤微生物群落發(fā)生變化的敏感碳源。

5)Pearson相關性分析表明，土壤有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀對土壤微生物功能多樣性影響較大，供試土壤微生物功能多樣性與土壤有機質、堿解氮含量呈正相關關系，與有效磷、速效鉀含量呈負相關關系。

[1] 朱寧, 馬驥. 中國畜禽糞便產生量的變動特征及未來發(fā)展展望[J]. 農業(yè)展望, 2014, 10(1): 46–48, 74.

[2] 王璟. 畜禽養(yǎng)殖污染的危害、主要原因及防治對策[J]. 養(yǎng)殖與飼料, 2018(11): 112–113.

[3] 楊樂, 王開勇, 龐瑋, 等. 新疆綠洲區(qū)連續(xù)五年施用沼液對農田土壤質量的影響[J]. 中國土壤與肥料, 2012(5): 17–21.

[4] 博文靜, 郭立月, 李靜, 等. 不同耕作與施肥方式對有機玉米田雜草群落和作物產量的影響[J]. 植物學報, 2012, 47(6): 637–644.

[5] 李松林, 呂軍, 張峰, 等. 高濃度沼液淹灌土水系統(tǒng)中氮、磷和有機物的動態(tài)變化[J]. 水土保持學報, 2011, 25(2): 125–129.

[6] 唐微, 伍鈞, 孫百曄, 等. 沼液不同施用量對水稻產量及稻米品質的影響[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報, 2010, 29(12): 2268–2273.

[7] 汪吉東, 曹云, 常志州, 等. 沼液配施化肥對太湖地區(qū)水蜜桃品質及土壤氮素累積的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2013, 19(2): 379–386.

[8] 曹云, 常志州, 馬艷, 等. 沼液施用對辣椒疫病的防治效果及對土壤生物學特性的影響[J]. 中國農業(yè)科學, 2013, 46(3): 507–516.

[9] 尚斌, 陳永杏, 陶秀萍, 等. 豬場沼液對蔬菜病原菌的抑制作用[J]. 生態(tài)學報, 2011, 31(9): 2509–2515.

[10] Galvez A, Sinicco T, Cayuela M L, et al. Short term effects of bioenergy by-products on soil C and N dynamics, nutrient availability and biochemical properties[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2012, 160: 3–14.

[11] Abubaker J, Risberg K, Pell M. Biogas residues as fertilisers - Effects on wheat growth and soil microbial activities[J]. Applied Energy, 2012, 99: 126–134.

[12] Terhoeven-Urselmans T, Scheller E, Raubuch M, et al. CO2evolution and N mineralization after biogas slurry application in the field and its yield effects on spring barley[J]. Applied Soil Ecology, 2009, 42(3): 297–302.

[13] Gu Y F, Zhang X P, Tu S H, et al. Soil microbial biomass, crop yields, and bacterial community structure as affected by long-term fertilizer treatments under wheat-rice cropping[J]. European Journal of Soil Biology, 2009, 45(3): 239–246.

[14] 吳松芹, 汪成忠, 李夢莎. 模擬氮沉降對濱海濕地土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 土壤, 2017, 49(6): 1153–1158.

[15] 胡君利, 林先貴, 褚海燕, 等. 種植水稻對古水稻土與現(xiàn)代水稻土微生物功能多樣性的影響[J]. 土壤學報, 2007, 44(2): 280–287.

[16] 鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 3版. 北京: 中國農業(yè)出版社, 2000: 30–83.

[17] 張旭. 不同耕作措施對隴中黃土高原土壤微生物功能多樣性的影響[D]. 蘭州: 甘肅農業(yè)大學, 2017.

[18] Schutter M, Dick R. Shifts in substrate utilization potential and structure of soil microbial communities in response to carbon substrates[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2001, 33(11):1481–1491.

[19] 田雅楠, 王紅旗. Biolog法在環(huán)境微生物功能多樣性研究中的應用[J]. 環(huán)境科學與技術, 2011, 34(3): 50–57.

[20] 鄒春嬌, 齊明芳, 馬建, 等. Biolog-ECO解析黃瓜連作營養(yǎng)基質中微生物群落結構多樣性特征[J]. 中國農業(yè)科學, 2016, 49(5): 942–951.

[21] 張紅, 呂家瓏, 曹瑩菲, 等. 不同植物秸稈腐解特性與土壤微生物功能多樣性研究[J]. 土壤學報, 2014, 51(4): 743–752.

[22] 唐海明, 肖小平, 李微艷, 等. 長期施肥對雙季稻田根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2016, 25(3): 402–408.

[23] 李娟, 趙秉強, 李秀英, 等. 長期不同施肥制度下幾種土壤微生物學特征變化[J]. 植物生態(tài)學報, 2008, 32(4): 891–899.

[24] 孫瑞蓮, 趙秉強, 朱魯生, 等. 長期定位施肥對土壤酶活性的影響及其調控土壤肥力的作用[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2003, 9(4): 406–410.

[25] 王偉, 德科加. 不同氮肥及施氮水平對稱多縣高寒草甸生物量和養(yǎng)分的影響[J]. 草地學報, 2015, 23(5): 968–977.

[26] 劉敏, 王長庭, 字洪標, 等. 火燒干擾下高寒草甸土壤微生物群落功能多樣性變化特征[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2016, 22(2): 263–270.

[27] 王晶晶, 樊偉, 崔珺, 等. 氮磷添加對亞熱帶常綠闊葉林土壤微生物群落特征的影響[J]. 生態(tài)學報, 2017, 37(24): 8361–8373.

[28] Li F L, Liu M, Li Z P, et al. Changes in soil microbial biomass and functional diversity with a nitrogen gradient in soil columns[J]. Applied Soil Ecology, 2013, 64:1–6.

[29] 張玥琦, 劉慧, 趙鳳艷, 等. 不同施肥措施對番茄連作土壤酚酸含量和微生物功能多樣性的調節(jié)[J]. 土壤通報, 2017, 48(4): 887–894.

[30] 李軼, 唐佳妮, 呂緒鳳, 等. 施用沼肥對設施土壤真菌動態(tài)變化的影響[J]. 中國沼氣, 2013, 31(5): 29–31, 39.

[31] 趙帆, 趙密珍, 王鈺, 等. 基于高通量測序研究草莓根際微生物群落結構和多樣性[J]. 土壤, 2019, 51(1): 51-60.

[32] 鄭學博, 樊劍波, 崔鍵, 等. 沼液還田對旱地紅壤微生物群落代謝與多樣性的影響[J]. 生態(tài)學報, 2016, 36(18): 5865–5875.

[33] Yao M J, Rui J P, Li J B, et al. Rate-specific responses of prokaryotic diversity and structure to nitrogen deposition in the Leymus chinensis steppe[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 79:81–90.

[34] 代迪, 字洪標, 楊有芳, 等. 高寒草甸土壤微生物功能多樣性對氮肥添加的響應[J]. 水土保持研究, 2018, 25(2): 137–144.

[35] Edwards K A, Clancy H A, Baeumner A J. Bacillus anthracis: toxicology, epidemiology and current rapid- detection methods[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, 384(1): 73–84.

[36] 郝曉暉, 胡榮桂, 吳金水, 等. 長期施肥對稻田土壤有機氮、微生物生物量及功能多樣性的影響[J]. 應用生態(tài)學報, 2010, 21(6): 1477–1484.

[37] Dalmonech D, Lagomarsino A, Moscatelli M C, et al. Microbial performance under increasing nitrogen availability in a Mediterranean forest soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42(9):1596–1606.

[38] 鐘芳, 趙瑾, 孫榮高, 等. 蘭州南北兩山五類喬灌木林草地土壤養(yǎng)分與土壤微生物空間分布研究[J]. 草業(yè)學報, 2010, 19(3): 94–101.

Effects of Biogas Slurry on Soil Microbial Functional Diversity of Vineyard in Hexi Oasis

HAO Yan, LI Jingxia, SUN Xiaomei, CHEN Nianlai*

(College of Resources and Environment, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

A 2 a field experiment was conducted in Qilian Grape Sightseeing Garden of Gansu Province in order to investigate the effects of biogas slurry application amount and year on soil quality and soil microbial functional diversity. The designed treatments included CK treatment (pure chemical fertilizer, N 180 kg/hm2, P2O5150 kg/hm2, K2O 22.5 kg/hm2), biogas slurry replacing chemical fertilizer treatments (biogas slurry nitrogen replaced 33%, 67% and 100% of chemical fertilizer nitrogen), and increasing biogas slurry treatments (biogas slurry nitrogen were 133%, 167% and 200% of chemical fertilizer nitrogen). Soil microbial functional diversity was determined by Biolog method. The results showed that metabolic activity of soil microbial community was the lowest in 100% biogas slurry treatment but the highest in 33% biogas slurry treatment. Meanwhile the differences in metabolic activity between the treatments with 2 a application biogas slurry were greater than those of 1a. The main carbon sources used by soil microbes were carbohydrates, biogas slurry application significantly increased the utilization rates of amino acids and carboxylic acids. Under the condition of applying biogas slurry for 2 a, the effects of 133% and 167% biogas slurry treatments were better than those of other treatments. Compared with CK, biogas slurry application only had obvious advantage in promoting the McIntosh index, and the effects of 133% and 167% biogas slurry treatments were better than those of other treatments. Principal component analysis (PCA) showed that biogas slurry applying amount and year had different effects on soil microbial carbon source utilization rate and metabolic diversity, and the variation degree among treatments increased with increasing applying year of biogas slurry. Carbohydrates and amino acids were the main carbon sources that caused the differentiation of soil microbial functional groups treated with different amounts of biogas slurry, and carbohydrates were the sensitive carbon sources for soil microbial community changes after the increase of applying year of biogas slurry. Pearson correlation analysis showed that soil microbial community functional diversity had positive correlation with soil organic matter and available N, and negative correlation with available P and K. In conclusion, biogas slurry application (particularly combined with chemical fertilizer) is beneficial to improve soil microbial metabolic activity and soil microbial community functional diversity, and it can completely replace chemical fertilizer when enough amount is applied.

Biogas slurry; Application years; Biolog-ECO microplate method; Soil microbial functional diversity

S154.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.06.015

郝燕, 李金霞, 孫小妹, 等. 沼液對河西綠洲葡萄園土壤微生物功能多樣性的影響. 土壤, 2020, 52(6): 1203–1211.

甘肅農業(yè)大學盛彤笙科技創(chuàng)新基金項目(31270472)和沼液綜合利用研究項目(037036235)資助。

(chennl@gsau.edu.cn)

郝燕(1992—)，女，江蘇揚州人，碩士研究生，主要從事植物生態(tài)學研究。E-mail: 1447397812@qq.com