池上評(píng),梁光紅,江傳陽,華偉平

(1.福建省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)院，福建 福州 350003；2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350005；3.福建省晉江坫頭國有防護(hù)林場，福建 泉州 362246；4.武夷學(xué)院，福建 武夷山 354300)

1 引言

秋茄(Kandeliacandel) 是我國東南沿海的珍貴木本植物群落——紅樹林(Mangrove)的主要造林樹種[1]，具有重要保護(hù)價(jià)值。因?yàn)榧t樹林對(duì)調(diào)節(jié)全球的氣候變化具有十分重要的意義[2,3]，又因其具有豐富的生物量而具有巨大的生態(tài)價(jià)值[4，5]；同時(shí)，完整的紅樹林不僅可以為人類提供良好的游憩場所，又是一個(gè)藥源寶庫，因此具有很高的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6，7]。目前秋茄的自然分布北界位于福建北部，緯度為27°20′N ，浙江溫州有少量人工栽培[8～10]。一般采用胚軸(胎生苗)直接插植進(jìn)行繁殖，不僅繁殖方式單一，還存在繁殖周期較長、效率低、可控性差、人工移植成活率低、成本高及不易大面積推廣等系列問題。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在林業(yè)上的應(yīng)用[11]，研究如何利用組織培養(yǎng)這一技術(shù)來解決秋茄擴(kuò)大繁殖的問題是十分有意義的。目前，對(duì)于秋茄的組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道還很少，2007年黃有軍以秋茄頂芽和幼葉為外植體研究了光照和黑暗條件下，不同激素配比對(duì)愈傷組織形成的影響[12]。結(jié)果表明，外源生長素對(duì)秋茄的幼葉愈傷組織形成是必需的，1mg/L2, 4-D 或4mg/L以上的NAA 對(duì)愈傷組織形成有較好作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立紅樹秋茄的愈傷組織體系，一方面可以對(duì)其種質(zhì)資源進(jìn)行離體保存，有利于深入保護(hù)和開拓紅樹林植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性；同時(shí)為建立再生體系，實(shí)現(xiàn)快速繁殖奠定基礎(chǔ)，以最終滿足沿海防護(hù)林建設(shè)的生產(chǎn)要求。對(duì)于發(fā)展與保護(hù)紅樹林資源、促進(jìn)紅樹林生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)都具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

選自福建省晉江坫頭國有防護(hù)林場紅樹植物秋茄的幼葉作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 秋茄愈傷組織形成

對(duì)新鮮的外植體進(jìn)行挑選，取其嫩葉，將外植體在洗潔精溶液中浸泡5 min，自來水沖洗2 h，在無菌條件下將外植體置于75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗一次；然后用0.2%升汞溶液消毒8 min，無菌水漂洗4～5次，切取約9 cm2大小的葉塊接種在不同激素配比的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。定期觀察葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和生長情況。

2.2.2 不同激素配比對(duì)秋茄愈傷組織形成的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源生長素：2,4-D、細(xì)胞分裂素6-BA作激素配比完全試驗(yàn)，其中，pH值為5.8。置于25 ℃，完全黑暗條件下培養(yǎng)。每處理接種20瓶。培養(yǎng)20 d、30 d、40 d后，觀察記錄愈傷形成情況，并記錄葉片誘導(dǎo)數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率(表1)。

表1 對(duì)秋茄愈傷組織誘導(dǎo)的不同激素配比

2.2.3 對(duì)秋茄葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基篩選

在通過不同激素配比對(duì)愈傷組織形成的影響試驗(yàn)來初步篩選出合適的激素配比的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選出較高效的激素配比。同樣以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源生長素：2,4-D、細(xì)胞分裂素6-BA作激素配比完全試驗(yàn)，并加入瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L， pH值為5.8。置于25 ℃，完全黑暗條件下培養(yǎng)。每處理接種20瓶。培養(yǎng)20 d、30 d、40 d后，觀察記錄愈傷生長狀況，并記錄葉片誘導(dǎo)數(shù)(表2)。

表2 篩選誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基的激素配比

2.2.4 不同消毒時(shí)間對(duì)秋茄嫩葉消毒效果的影響

不同消毒時(shí)間對(duì)秋茄嫩葉、莖尖等消毒效果的影響：分別比較0.2%升汞溶液消毒8 min、3 min+5 min、10 min、4 min+6 min對(duì)消毒效果(污染率)以及成活率的影響。其中，“+”為消毒時(shí)間間隔，時(shí)間為2 min。將外植體切成適合大小，接種于MS培養(yǎng)基中。每處理接20瓶，每瓶接4個(gè)葉塊。培養(yǎng)20 d后，觀察、記錄。

成活率=成活數(shù)(瓶)/接種數(shù)(瓶)×100%

污染率=污染數(shù)(瓶)/接種數(shù)(瓶)×100%

2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為(25 ± 2) ℃，培養(yǎng)室的相對(duì)濕度保持在70%～80%水平，光強(qiáng)為1000～1500 lx，每天光照時(shí)間12 h，暗處理則以報(bào)紙或牛皮紙覆蓋。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

全文數(shù)據(jù)采用excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織形成

接種20d 后在切口處略能看到愈傷組織，呈淡綠色；30d 左右愈傷組織逐漸明顯，松散，呈淡黃色；40d左右愈傷組織呈淡黃色，且不再擴(kuò)大。約60d 愈傷組織開始變成黃褐色(圖1)。

圖1 愈傷組織的形成

2.2 不同激素配比對(duì)愈傷組織形成的影響

由表3可知，不加激素條件下，外植體在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)不能形成愈傷組織，僅施加外源細(xì)胞分裂素(BA) 而無外源生長素，同樣不能形成愈傷組織，而在施加外源生長素的前提下，BA在一定的水平下，愈傷組織均可發(fā)生,說明外源生長素對(duì)秋茄樹幼葉的愈傷組織形成是必需的。2, 4-D 能誘導(dǎo)愈傷組織的形成，2, 4-D 1 mg/ L 較0. 5 mg/ L 有更好的誘導(dǎo)率，如培養(yǎng)基處理11誘導(dǎo)率比處理7 高，處理10比處理6高，處理12比處理8高。當(dāng)2, 4-D 濃度提高到2 mg/ L 時(shí)誘導(dǎo)率下降。在不添加外源BA 的前提下處理14的愈傷組織能夠發(fā)生，但形成率不高；而添加了外源BA 后，形成率有一定程度提高，其中處理15最高，達(dá)10 %。當(dāng)BA 濃度達(dá)4 mg/ L 時(shí)，愈傷組織形成率有所下降，說明一定濃度的BA 在愈傷組織形成過程中有增進(jìn)作用，但濃度不能過高。

表3 不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果

3.3 對(duì)葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基篩選

由表4可知，在通過不同激素配比對(duì)愈傷組織形成的影響試驗(yàn)來初步篩選出合適的激素配比的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選出較高效的激素配比。其中，處理4激素配比的誘導(dǎo)率最高達(dá)到40%，較其它激素配比都較高，且與表1所得結(jié)論相符，得到葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素配比：MS+1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA。

表4 愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基篩選

3.4 不同消毒時(shí)間對(duì)秋茄幼葉消毒效果的影響

由表5可知，用0.2%升汞溶液對(duì)外植體進(jìn)行連續(xù)的8 min處理的成活率最高，達(dá)到65%，污染率最低，為35%；此外，對(duì)外植體依次進(jìn)行3 min+5 min、4 min+6 min、10 min處理的成活率由高變低，依次為55%、50%、45%，污染率由低變高，依次為45%、50%、55%。說明用0.2%升汞溶液對(duì)外植體進(jìn)行消毒時(shí)間不能過長，而且在合適的時(shí)間內(nèi)連續(xù)消毒會(huì)比間隔、多次消毒效果較好。

表5 不同消毒時(shí)間對(duì)秋茄幼葉消毒效果的影響

4 討論

4.1 秋茄愈傷組織形成條件

本試驗(yàn)表明：幼葉可以作為紅樹秋茄組織培養(yǎng)的外植體。同時(shí)，在挑選外植體材料時(shí)，要求所挑選的材料要盡量選取葉片的幼嫩部位，且無機(jī)械損傷，防止其在試驗(yàn)的消毒過程中消毒劑傷害到外植體的細(xì)胞，使外植體在誘導(dǎo)愈傷的過程中容易發(fā)生褐變[13]。

4.2 外源物質(zhì)對(duì)秋茄愈傷組織的形成的影響

外源生長素對(duì)秋茄的幼葉愈傷組織形成是必需的，這與銀杏愈傷組織誘導(dǎo)一致[14]。本試驗(yàn)通過篩選，得到對(duì)葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素配比為MS+1 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L 6-BA。即當(dāng)2, 4-D 濃度在1 mg/ L 時(shí)有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，添加一定量的外源BA 有助于提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但過高的外源BA 則抑制愈傷組織的發(fā)生。據(jù)報(bào)道[15～17]，外源物質(zhì)活性炭在組織技術(shù)上具有廣泛的應(yīng)用，特別是用活性炭來預(yù)防外植體褐變的發(fā)生具有重要的作用[18]，值得在今后的深入研究。

4.3 試驗(yàn)消毒和操作方法的討論

秋茄嫩葉消毒時(shí)間連續(xù)進(jìn)行8min的成活率最高，污染率最低。組織培養(yǎng)對(duì)于試驗(yàn)操作環(huán)境要求很高，在進(jìn)行組織培養(yǎng)的過程中，要保持操作環(huán)境始終在無菌環(huán)境下；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)員在試驗(yàn)操作過程中應(yīng)該要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)則和試驗(yàn)操作流程規(guī)則，保持優(yōu)良的試驗(yàn)環(huán)境及對(duì)試驗(yàn)操作平臺(tái)和儀器進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，特別注意操作人員的操作手的消毒；此外，試驗(yàn)操作人員要注意一些實(shí)驗(yàn)操作技巧，培養(yǎng)自己的試驗(yàn)操作風(fēng)格，以降低試驗(yàn)污染率。