翁宗昱,李紫晗,孫 琴,王元清
(中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410004)
肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)原名菌桂、牡桂,系樟科樟屬,是重要的藥用和食用植物,國產(chǎn)肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)的干燥樹皮[1],主要分布于廣西、廣東等地,廣西的產(chǎn)量占全國的50%。肉桂中主要含有揮發(fā)油、黃酮、黃烷醇、萜類、木質(zhì)素、多酚、香豆素、皂苷、多糖等多種類型的化合物[2]。揮發(fā)油為肉桂的主要活性部位,其中主要有桂皮醛、桂皮醇、甲氧基桂皮醛、α-蒎烯、α-蓽澄茄油萜等[2-3],現(xiàn)代藥理研究表明肉桂具有減弱腸胃刺激、強(qiáng)心、改善微循環(huán)、抗炎等多種生理活性[4]?,F(xiàn)代藥理研究亦表明肉桂揮發(fā)油中主要成分為桂皮醛,具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、降糖、抗菌、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗心肌缺血和抗凝血等多種藥理作用[5-8]?,F(xiàn)有研究有對肉桂精油提取方法進(jìn)行報(bào)道[9-10],但是肉桂采用水蒸氣蒸餾法提取時(shí),通常只對精油進(jìn)行研究,沒有對蒸餾時(shí)的芳香水液進(jìn)行分析。本研究對肉桂中抗菌活性部位進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)提取工藝優(yōu)化及主要成分定量分析,以期為肉桂在食品藥品中的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。
202-OA型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);SPX-250-GB型恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);G154DW型立式自動壓力蒸汽滅菌器(致微(廈門)儀器有限公司);YP1002N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);BIO-KONT型比濁管(康泰生物);1-Hole Punch打孔機(jī)(上海堅(jiān)明辦公用品有限公司);TS-111B型搖床(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。
肉桂(批號:15120717,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):《中國藥典》2015版,湖南振興中藥飲片實(shí)業(yè)有限公司);牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);蛋白胨(上海禽類蛋品公司禽蛋二廠);NaCl(西隴化工股份有限公司);無菌水(自制);肉桂酸對照品(南昌貝塔生物科技有限公司);桂皮醛(南昌貝塔生物科技有限公司)。
2.1.1 肉桂提取 將100 g肉桂利用水蒸氣蒸餾法提取出肉桂揮發(fā)油并收集蒸餾后的芳香水液,將收集好的芳香水液濃縮后定容至100 mL,制得濃度為1 g/mL的濾液,冷藏備用。
2.1.2 抑菌活性篩選 采用濾紙片法測定抑菌活性。移取7 μL的肉桂精油或肉桂濾液分別滴加至兩片直徑為6 mm 的滅菌濾紙片上,使其充分吸附。另外移取7 μL生理鹽水滴加至另一片直徑6 mm的濾紙片上,作為陰性對照。將上述3片濾紙片均勻放置于含有金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌種的平板上,置恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)24 h后,觀察有無抑菌圈篩選肉桂抑菌活性部位。
利用水蒸氣蒸餾法提取出肉桂精油,分別對浸泡時(shí)間、加水量以及蒸餾時(shí)間進(jìn)行考察,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行均勻設(shè)計(jì),獲取肉桂精油的最佳提取工藝參數(shù)。
2.3.1 對照品溶液配制 精密稱取肉桂酸與桂皮醛對照品適量,置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,獲得含21 μg/mL的肉桂酸與222 μg/mL的桂皮醛混合對照品溶液。
2.3.2 肉桂精油樣品制備 各取100 μL肉桂精油加900 μL甲醇于EP管中,混勻,再取50 μL加1 950 μL甲醇置于5 mL EP管中,混勻,過濾,即得肉桂精油的液相色譜樣品。
2.3.3 色譜條件 安捷倫色譜柱C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速0.9 mL/min,λ=254 nm,進(jìn)樣量:10 μL,乙腈:0.1%磷酸水為流動相,時(shí)間(min):0-15-27-35-38-40,乙腈(%):28-28-35-85-85-28。
2.3.4 樣品含量測定 取樣品與混合對照品在上述色譜條件下進(jìn)樣測定,采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算精油中肉桂酸與桂皮醛的含量。
采用濾紙片研究肉桂精油和肉桂水液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性圖,抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。由圖1可知,肉桂經(jīng)水蒸氣蒸餾法獲得的肉桂精油有明顯的抑菌圈,而蒸餾時(shí)的芳香水提液沒有抑菌圈,表明肉桂精油對金黃色葡萄球菌具有抑制作用,而芳香水液無抑菌作用,從而篩選出肉桂抑菌活性部位為精油。
圖1 肉桂精油(A)、肉桂芳香水液(B)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果
選擇影響精油提取率的幾個(gè)主要因素:浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見圖2,為均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
浸泡時(shí)間的影響:每份100 g剪碎的肉桂均加水600 mL,不同的浸泡時(shí)間(0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h),提取時(shí)間均為6 h,考察不同浸泡時(shí)間的精油提取量。由圖2可知,浸泡時(shí)間為0.5 h時(shí),肉桂精油的提取量最高;隨著浸泡時(shí)間的延長,肉桂精油提取量變化不明顯。可能在0.5 h內(nèi),溶液已經(jīng)充分滲透進(jìn)肉桂粗粉組織中,使組織中達(dá)到飽和。
加水量的影響:每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h,提取時(shí)間為6 h,考察加水量為600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 000 mL時(shí)的精油提取量。由圖2可知,加水量為700 mL時(shí),揮發(fā)油提取量最多,隨著加水量的增加,肉桂精油提取量變化不大;加水量較少時(shí),提取量較低。加水量少時(shí),產(chǎn)生的水蒸汽較少,從而隨水蒸汽蒸餾出來的油量也少;但加水量太多時(shí),可能是因?yàn)榉枷闼芤褐械挠洼^多,從而使收集到的精油量減弱。
提取時(shí)間的影響:每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h,加水700 mL,考察蒸餾時(shí)間為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的精油提取量。由圖2可知,提取時(shí)間在4~7 h時(shí),隨著提取時(shí)間的增加而提取量增加,7 h時(shí)提取量較高;隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長,略有減少,可能時(shí)間太長導(dǎo)致精油揮發(fā)損失而減少。
圖2 各因素對肉桂精油提取量的影響
3.3.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)之后,設(shè)計(jì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)來優(yōu)化工藝。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平。本實(shí)驗(yàn)均勻設(shè)計(jì)采用3因素5水平:浸泡時(shí)間分別為0 min、20 min、40 min、60 min、80 min;蒸餾時(shí)間分別為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h;加水量分別為6倍量(600 mL)、7倍量(700 mL)、8倍量(800 mL)、9倍量(900 mL)、10倍量(1 000 mL)。因素水平設(shè)計(jì)見表1。按均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn),分別收集精油,量取體積,結(jié)果見表2。
表1 U5*(53)均勻設(shè)計(jì)因素水平
表2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果
表3 回歸模型方差分析結(jié)果
表4 回歸模型系數(shù)及檢驗(yàn)結(jié)果
3.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取剪碎的肉桂3份各100 g,均按優(yōu)選出來的肉桂精油最佳水蒸汽蒸餾提取工藝提取3次,即浸泡20 min,加水量600 mL,提取時(shí)間8 h進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取,收集精油量,結(jié)果見表5。3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值為1.72 mL,與預(yù)測結(jié)果接近。所以經(jīng)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選,肉桂抑菌活性部位精油的水蒸氣蒸餾提取工藝為100 g粗粉浸泡20 min,加水量為 600 mL(6倍量),提取時(shí)間為8 h。
表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
3.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察結(jié)果 采用“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣,對照品及樣品的色譜見圖3,可見在上述色譜條件下,樣品和對照品的色譜分離度較好,無干擾。
3.4.2 肉桂精油的定量分析結(jié)果 采用“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣,樣品中的各成分含量測定結(jié)果見表4。由表4可知,肉桂精油中桂皮醛含量高達(dá)629.38 mg/g,超過50%;肉桂酸含量為18.76 mg/g。
表6 肉桂精油中肉桂酸與桂皮醛含量結(jié)果
抑菌活性篩選研究中,雖有文獻(xiàn)[10]報(bào)道肉桂精油的抑菌活性,但沒有研究比較肉桂水蒸氣蒸餾時(shí)精油與芳香水液的活性。該研究通過抑菌實(shí)驗(yàn)對肉桂水蒸氣蒸餾的提取部位進(jìn)行抑菌活性篩選,研究發(fā)現(xiàn),主要是精油部位具有抑菌活性,可能與肉桂的主要活性成分桂皮醛有關(guān)。文獻(xiàn)[2]報(bào)道,桂皮醛具有揮發(fā)性,也是肉桂精油中的主要活性成分。在水蒸氣蒸餾過程中,主要活性成分集中于精油中,從而芳香水液沒有體現(xiàn)出抑菌活性。
在提取工藝研究中,經(jīng)單因素試驗(yàn)后再采用均勻設(shè)計(jì)法對肉桂抑菌活性部位精油進(jìn)行蒸餾優(yōu)選,獲得其最佳蒸餾提取工藝條件為100 g,肉桂浸泡20 min,加水量為 6倍量(600 mL),提取時(shí)間為8 h。優(yōu)選出來的工藝經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證可行,可為肉桂精油的蒸餾提取與產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。
1-肉桂酸;2-桂皮醛
肉桂精油主要成分分析中,桂皮醛含量高達(dá)629.38 mg/g,在精油中超過了50%,充分說明桂皮醛是肉桂精油的主要成分;本研究中的桂皮醛含量與文獻(xiàn)[10]有一定差異,可能與肉桂的產(chǎn)地、采收、加工及生產(chǎn)時(shí)間有一定關(guān)系。