王 敏，李習平，楊 梅，齊 玲，張珍達，謝 薇

(貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約167.1萬，每年病死病例約52.2萬。而在我國，乳腺癌每年新發(fā)病例約21萬，居女性惡性腫瘤之首，且近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-3]。然而在乳腺癌當下的治療中，盡管方法不盡相同，但結(jié)果卻大同小異，依然呈現(xiàn)出高復發(fā)、高轉(zhuǎn)移和高死亡率等特點。因此，對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制的進一步闡明對乳腺癌的繼續(xù)研究及防治至關(guān)重要。目前研究表明，乳腺癌具有多種分子亞型，且不同亞型對于化療、放療及靶向藥物等治療方式的敏感程度亦不盡相同。此外，目前在乳腺癌相關(guān)生物信息學方面的研究亦取得較大進步，不僅發(fā)現(xiàn)了一系列與乳腺癌相關(guān)的調(diào)控通路及信號因子，還對基因間相互作用做了較為系統(tǒng)的研究，從而為其早期診斷、分級治療和靶向藥物選擇提供了更為堅實的理論依據(jù)[4]。研究[5]指出，細胞凋亡異常是腫瘤、自身免疫疾病和神經(jīng)退行性病變等發(fā)生和發(fā)展的重要影響因素。而正常的細胞凋亡程序亦是多細胞有機體維持體內(nèi)平衡和發(fā)育過程的一個重要機制，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的負調(diào)控作用能夠有效遏制腫瘤細胞的增殖。已有研究[6]發(fā)現(xiàn)，在大多腫瘤組織(包括卵巢腫瘤、乳腺癌、胰腺癌和肝癌等)細胞中均存在 Caspase 系列蛋白(如Caspase-3、8、9等)異常表達，甚至某些Caspase家族蛋白在凋亡調(diào)節(jié)中起著重要的樞紐作用?，F(xiàn)利用文獻總結(jié)Caspase信號通路在乳腺癌臨床治療中的研究進展，并進一步討論其在乳腺癌靶向治療中的臨床策略。

1 Caspase信號途徑概述

1.1 Caspase蛋白家族及分類 1993年，Yuan等發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲(C.elegan)中的Ced-3基因與Ced-4基因是引導細胞凋亡的必經(jīng)途徑，而哺乳動物中的IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)在功能和序列上又與Ced存在高度相似性，且都與細胞凋亡的誘導息息相關(guān)，故兩者在后來被統(tǒng)稱為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase，Caspase)。研究發(fā)現(xiàn)，所有Caspases均具N-端的半胱氨酸激活位點及底物裂解位點，其底物特異性由其裂解位點N-端的4個氨基酸殘基決定，底物裂解部位通常位于靶蛋白一級結(jié)構(gòu)中的門冬氨酸殘基且數(shù)目不等。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)并克隆的Caspase系列蛋白酶共14種，按其在凋亡調(diào)節(jié)中作用的不同分為三類：①炎癥介導因子(如Caspase-1、4、5、11)除了介導炎癥反應(yīng)外，還在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起著重要的輔助作用；②凋亡啟動因子處于級聯(lián)反應(yīng)的上游，能夠接受上游凋亡信號發(fā)生自我活化和特異識別并激活下游凋亡效應(yīng)Caspase，包括Caspase-2、8、9、10等，其中Caspase-8對幾乎所有效應(yīng)Caspase分子均能激活而誘發(fā)凋亡[7]；③凋亡執(zhí)行因子亦稱凋亡效應(yīng)因子，處于級聯(lián)反應(yīng)下游，主要承擔細胞凋亡過程，如Caspase-3、6、7，其中Caspase-3是細胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子，它的活化是凋亡進入不可逆階段的一個重要標志[8]。

1.2 Caspase信號傳導相關(guān)凋亡途徑 目前，已知凋亡所涉途徑共有4條，分別為內(nèi)源性途徑、外源性途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑及顆粒酶B途徑。近年來，針對前兩種途徑的研究較多，而在顆粒酶B途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的了解上則相對較為薄弱。雖然4種途徑均有Caspase參與，但Caspase主要通過內(nèi)源性和外源性途徑發(fā)揮凋亡調(diào)控作用。為了更為系統(tǒng)地了解細胞凋亡的調(diào)控機制，現(xiàn)就上述4種凋亡途徑及其常見調(diào)節(jié)信號因子進行綜述。

1.2.1 內(nèi)源性途徑：該途徑又稱線粒體通路，通過胞內(nèi)的死亡信號刺激線粒體外膜，誘導線粒體膜通透性發(fā)生改變，致使跨膜電位丟失，繼而釋放細胞色素C與胞質(zhì)中凋亡激活因子(Apaf-1)相結(jié)合，再進一步激活Caspase-9酶原并與之結(jié)合組成凋亡復合體，活化后的Caspase-9 特異性切割Caspase-3使其活化，最終通過活化的Caspase-3促進核纖層核碎裂、蛋白分裂，從而導致凋亡[9]。此途徑眾多調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2家族是最為重要的調(diào)節(jié)因子之一，包含抗凋亡成員(如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-W等)和促凋亡成員(如Bax、Bik/Nbk、Bad、Bid等)兩類，其凋亡調(diào)節(jié)作用取決于抗凋亡因子與促凋亡調(diào)節(jié)因子比中的優(yōu)勢方，繼而通過細胞色素C的釋放進行細胞凋亡過程的調(diào)節(jié)。此外，生長因子的缺失、氧化應(yīng)激、鈣超載、致癌因子激活以及DNA 損傷等因素均可激活內(nèi)源性途徑。除細胞色素C外，線粒體還釋放核酸內(nèi)切酶G、細胞凋亡誘導因子和凋亡抑制蛋白拮抗劑(SMAC)等，這些分子同樣可以促進Caspase 依賴途徑的細胞凋亡。

1.2.2 外源性途徑：該途徑又稱為死亡受體途徑或胞質(zhì)途徑，依賴膜結(jié)合配體FasL和死亡受體并最終通過激活執(zhí)行者Caspase系列蛋白而觸發(fā)凋亡。死亡受體系腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族重要成員之一。迄今共發(fā)現(xiàn)TNF受體30種，其中8種位于胞質(zhì)內(nèi)，被譽為“死亡域”，且TNF-R1、Fas(Apo1)、DR3(Apo2)、DR4(Trail-R1)、DR5(Trail-R2)及DR6這6種TNF的受體死亡域與Caspase凋亡途徑的激活息息相關(guān)。該途徑具體表現(xiàn)為：細胞膜外的FasL通過與細胞膜表面相應(yīng)死亡受體結(jié)合構(gòu)成死亡誘導復合物，繼而激活Caspase通路，開啟凋亡外源性途徑。外源性途徑影響因素眾多，如Bcl-2蛋白家族、NF-κB、p53、死亡受體、細胞周期相關(guān)因子等，其中p53是一種能通過對前凋亡成員Bax、Bak產(chǎn)生直接或間接作用而發(fā)揮促凋亡功能的抑癌基因，但也有報道稱某些突變體p53能夠通過調(diào)節(jié)脫氧尿苷三磷酸酶表達而抑制凋亡。近年來研究表明，內(nèi)、外兩種凋亡調(diào)節(jié)途徑并非總是相互獨立的,亦可以相互交錯形成共同途徑，亦稱Caspase信號途徑。如在肝細胞凋亡的FAS應(yīng)答途徑中，由于Caspase-8的活化水平不足，受外源性途徑激活的Caspase-8能夠促使胞漿中的Bid激活并向線粒體遷移，通過內(nèi)源性途徑釋放SMAC進一步激活起始酶Caspase-8，進而將外源性途徑信號進一步放大，最終作用于執(zhí)行酶Caspase-3，啟動相應(yīng)凋亡程序[10]。

1.2.3 顆粒酶B(GrB)途徑：顆粒酶(Gr)是一類來自細胞毒T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷(NK)細胞的絲氨酸蛋白酶。目前，已知顆粒酶共11種，在人類發(fā)現(xiàn)有GrA、GrB、GrH、GrK和GrM共5種，其中GrB凋亡誘發(fā)活力最強[11]。該凋亡過程表現(xiàn)為：當CTL受到刺激后，以穿孔蛋白和GrB為主的毒性顆粒被釋放到細胞外，通過多種途徑作用于相應(yīng)靶細胞并引發(fā)凋亡的發(fā)生。研究[12]發(fā)現(xiàn)，GrB的凋亡調(diào)節(jié)途徑共有兩條，分別是Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑。GrB可以分別通過切割凋亡促進因子Bid和凋亡抑制因子Mcl-1激活內(nèi)源性途徑，誘發(fā)凋亡[13]。此外，GrB還可以直接遷移入核、直接激活除Caspase以外的胞漿底物或通過改變線粒體膜電位結(jié)構(gòu)等非Caspase依賴性途徑啟動凋亡程序[14]。

1.2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蛋白合成、加工以及Ga2+儲存的重要場所，其在細胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用近年來亦備受關(guān)注。目前已知，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過Caspase-12、非折疊蛋白效應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ga2+異常3條途徑參與細胞凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)過多積累的未折疊蛋白會特異性地與肌醇依賴酶1-α(Ire1-α)競爭BiP/Grp78，從而導致剩余Ire1-α與能特異吸附并激活Caspase-12的死亡受體相關(guān)因子TRAF2結(jié)合，進而開啟凋亡過程。同時，Caspase-12也能被細胞內(nèi)Ga2+激活的m-鈣激活酶切割并激活，且激活后的Caspase-12能直接通過激活Caspase-9，繞開線粒體途徑而誘發(fā)凋亡。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在通過Caspase-12直接開啟凋亡程序時，其釋放的Ga2+還可以直接引起線粒體膜通透性及膜電位改變，導致線粒體凋亡物質(zhì)的釋放，從而啟動和實施凋亡。有報道稱，線粒體途徑的細胞色素C能與Ga2+釋放影響因子肌醇1,4,5-三磷酸(InsP3)直接結(jié)合，引起Ga2+通道開放，從而增強對線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的刺激，進一步促進凋亡的發(fā)生。由此看來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑與線粒體途徑在細胞凋亡的調(diào)控中亦并不是完全孤立的，而是可以相互作用的[16]。目前對于Caspase-12的激活機制尚不明確，有研究[17]認為被活化的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞漿中首先作用于Caspase-9，再激活Caspase-3引起細胞凋亡，或Caspase-12直接激活了Caspase-3。而且，在近年對以上凋亡途徑的研究中，尚未發(fā)現(xiàn)Caspase-12參與內(nèi)、外源性途徑，這亦證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑亦具有一定的Caspase選擇特異性。

2 乳腺癌相關(guān)Caspase信號途徑

乳腺癌相關(guān)Caspase信號途徑受諸多凋亡調(diào)節(jié)因子的影響，尤以Bcl-2蛋白家族、TNF超家族、p53、凋亡蛋白抑制因子(IAP)、部分miRNA、人表皮生長因子受體2(HER-2)較多。但在不同途徑中的優(yōu)勢調(diào)節(jié)因子不盡相同，且機制各異。

2.1 Caspase相關(guān)內(nèi)源性途徑與乳腺癌 Caspase相關(guān)內(nèi)源性途徑與乳腺癌關(guān)系的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)為Bcl-2相關(guān)途徑。Talaiezadeh等[18]通過小干擾RNA介導的Bcl-2基因阻斷來處理乳腺癌細胞MCF-7，發(fā)現(xiàn)癌細胞生存率顯著降低，并且這一效應(yīng)在24 h最為明顯，說明了Bcl-2信號通路在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。Bcl-2作為最重要的凋亡調(diào)控因子之一，其表達受雌激素(ER)的調(diào)節(jié)[19]，且研究[20]指出存在ER/PR表達的乳腺癌組織對內(nèi)分泌抗癌治療較為敏感。同時，黃信等[21]通過對乳腺癌組織中Bcl-2表達的研究亦發(fā)現(xiàn)，高表達Bcl-2的乳腺組織往往惡性程度較低，且對內(nèi)分泌治療方法較敏感，因而具有更為樂觀的預后，并且分析了其原因可能包括：①Bcl-2在抑制凋亡的同時延長了細胞周期，從而在減緩增殖的基礎(chǔ)上減緩了腫瘤基因的變化，使得預后更好；②由于ER陽性乳腺癌對內(nèi)分泌治療敏感，而Bcl-2的表達又受ER的調(diào)節(jié)，因此Bcl-2高表達的乳腺癌組織對內(nèi)分泌調(diào)節(jié)治療較敏感，且預后較好；③可能由于其他一些如p53、Ki67及表皮生長因子受體等負性調(diào)節(jié)因子的影響，導致Bcl-2高表達的乳腺癌組織惡性程度通常較低，因而預后更為樂觀；④有可能隨著乳腺癌的發(fā)展，某些基因取代了Bcl-2的相關(guān)效能，導致Bcl-2低表達的乳腺癌組織惡性程度高而預后較差的結(jié)果。

2.2 Caspase相關(guān)外源性途徑與乳腺癌 外源性途徑研究中Fas及其相關(guān)配體FasL和TNF-R1備受關(guān)注。研究[22]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as及其配體FasL在誘導細胞凋亡的過程中具有重要意義，其中腫瘤FasL在T淋巴細胞的凋亡中就具有重要的誘導作用。李艷萍等[23]研究得出，F(xiàn)as/FasL的表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定相關(guān)性，隨著乳腺癌病情的發(fā)展，F(xiàn)as蛋白的表達率呈逐漸下降趨勢，而其配體FasL的表達則逐漸升高。同時，許曄瓊等[24]在Fas/FasL基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as基因啟動子-1377G>A和-670A>G以及FasL基因啟動子-844T>C基因型的多態(tài)性均與乳腺癌的發(fā)病具有一定的相關(guān)性。另外，TNF-R1作為腫瘤細胞微環(huán)境中介導TNF-α效應(yīng)的主要受體，廣泛存在于正常細胞及多種腫瘤細胞的表面[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)化的TNF-R1死亡復合物能夠觸發(fā)Caspase-8介導的凋亡效應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎、抗腫瘤效應(yīng)。但同時，還有報道[27]稱TNF-R1可以通過激活NF-κB而發(fā)揮抗凋亡作用。金蓮錦等[28]通過TNF-R1在乳腺癌中表達的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-R1在乳腺癌中呈高表達狀態(tài)，而在TNF-R1凋亡機制的研究中，當抑制MCF-7細胞中TNF-R1表達時，胞內(nèi)Caspase-8的表達出現(xiàn)明顯升高，而NF-κB則明顯下降，該結(jié)果提示MCF-7細胞中高表達的TNF-R1很有可能通過NF-κB信號途徑的激活抑制了Caspase-8通路的凋亡作用。然而，關(guān)于外源性途徑中各因子與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的確切機制還有待進一步研究確定。

3 乳腺癌Caspase信號途徑相關(guān)藥物治療

隨著乳腺癌凋亡機制研究的不斷深入，各種藥物的作用機制亦不斷清晰，對于凋亡的調(diào)控作用亦更為明了。在目前已知的四條主要凋亡途徑中，幾乎均有Caspase信號途徑的參與。黃茂杰等[29]研究發(fā)現(xiàn)，利用乳巖內(nèi)消霜透皮液干預MCF-10AT細胞可使Bax/Bcl-2比值明顯上升，活化的Caspase-9、Caspase-3及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表達亦明顯上調(diào)，足以證明乳巖內(nèi)消霜透皮液很可能通過對上調(diào)Bax/Bcl-2促進了細胞色素C的釋放，進而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)MCF-10AT細胞的凋亡。同時，王俊等[30]發(fā)現(xiàn)枸杞總黃酮(TFL)能夠促使MCF-7 細胞中Caspase-3 mRNA的表達逐漸升高，同時使Bcl-2 mRNA逐漸下降，進而通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)MCF-7 細胞的凋亡。吳穎等[31]研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林處理乳腺癌AU-565和MDA-MB-231細胞后，可分別促進裂解型Caspase-3和PARP表達的上調(diào)，而抗凋亡Bcl-2表達下調(diào)，表明Bcl-2/Caspase-3/PARP這一信號通路被激活，調(diào)控乳腺癌細胞的凋亡活動。田杰等[32]發(fā)現(xiàn)，土槿皮乙酸(PAD)可激活Caspase-8 和Caspase-9凋亡途徑，同時亦可通過P53蛋白誘導人乳腺癌細胞MCF-7走向凋亡。還有研究[33]發(fā)現(xiàn)血根堿(SAN)能夠抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖，其機制可能是通過升高細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，進而促進細胞凋亡。樸麗花等[34]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg3可明顯下調(diào)腫瘤組織proCaspase-3和proCaspase-9蛋白表達水平，其機制可能為活化癌組織Caspase-3和Caspase-9而誘導細胞凋亡。Won等[35]發(fā)現(xiàn)三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合衣霉素(TM)在誘導人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡方面有協(xié)同作用，使TM誘導的ERS細胞凋亡途徑中Caspase-12凋亡通路發(fā)生了改變，而TM可逆轉(zhuǎn)As2O3的促增殖作用為抑制增殖和促進凋亡效應(yīng)。徐正陽等[36]利用歐前胡素(IMP)上調(diào)T-47D細胞中DR5的表達成功促進了腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的線粒體途徑凋亡。另外，有研究[37]稱銀杏葉提取物(EGB)能增強MCF-7細胞 Caspases-3 蛋白的表達。此外，研究[38-39]發(fā)現(xiàn)阿法替尼不但可以通過抑制EGFR/PI3K/AKT通路信號轉(zhuǎn)導阻滯乳腺癌細胞于G0/G1期，阻斷乳腺癌細胞的增殖，還能促進乳腺癌細胞Caspase-3及PARP的剪切，進而通過Caspase途徑促進細胞凋亡。

4 結(jié) 語

雖然目前研究發(fā)現(xiàn)對乳腺癌有效的藥物較多，但患者接受治療后的效果卻并非十分理想。因此，在醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展革新的當下，除了不斷尋找新的治療途徑之外，可能更應(yīng)該把乳腺癌的治療看作是一個針對整體的治療，最終目的是誘導乳腺癌細胞的加速凋亡。不同凋亡分子途徑之間的相互作用及精準的調(diào)控方式將是未來乳腺癌治療研究的重中之重。