金建勇，孫玉煥

（青島科技大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院,山東青島 266042）

工業(yè)化和科技的快速發(fā)展導(dǎo)致了土壤被大量重金屬和類金屬污染，被污染土壤中的重金屬主要包括汞、鎘、鉛、鉻和類金屬砷等生物毒性顯著的元素，以及有一定毒性的鋅、銅、鎳等元素。重金屬在土壤中難以降解，是一種一旦出現(xiàn)，便長期存在的污染物，而且易進(jìn)入食物鏈，已成為人類和環(huán)境的一種主要威脅［1］。綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展，土壤重金屬污染的修復(fù)方法主要包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。物理修復(fù)是指使用電能或熱能將污染物質(zhì)固定或轉(zhuǎn)化為無毒或毒害性小的物質(zhì)，物理修復(fù)雖然周期短，但是應(yīng)用范圍小且能耗大；化學(xué)修復(fù)是使用還原劑或其它藥劑將毒性高、遷移性強(qiáng)、穩(wěn)定性差的重金屬或類金屬還原為毒性很小、穩(wěn)定性較強(qiáng)的價態(tài)或者化合物，修復(fù)周期短且具有成本效益，但是引入其它藥劑后容易造成二次污染且不穩(wěn)定，如有研究表明Cr（III）在經(jīng)過一段時間的化學(xué)還原后，可能再被氧化為Cr（VI）［2-3］。固定化微生物技術(shù)是生物修復(fù)技術(shù)中的一種，相對于物理和化學(xué)的方法，固定化微生物技術(shù)彌補(bǔ)了許多傳統(tǒng)修復(fù)方法存在的問題，固定化微生物技術(shù)以微生物為對象，著重于資源的再利用，具有成本低廉，高效穩(wěn)定，后期維護(hù)方便，極大降低了二次污染等優(yōu)點(diǎn)，從而能成為一種重要的土壤重金屬污染修復(fù)方法［4］。

在被重金屬污染的區(qū)域，往往存在對此重金屬抗性極大的微生物，而且許多天然或轉(zhuǎn)基因微生物具有降解、轉(zhuǎn)化或螯合各種有毒化學(xué)物質(zhì)的能力。固定化微生物技術(shù)是利用物理或化學(xué)手段將這種具有特定功能的微生物固定于載體材料內(nèi)部或表面，加以有效利用來處理污染物的技術(shù)。1959年Hattori［5］將大腸桿菌固定在樹脂載體上，首次實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的固定化，自此揭開了固定化微生物技術(shù)的篇章。本綜述闡述了固定化微生物技術(shù)在土壤重金屬污染修復(fù)中的研究進(jìn)展。

1 固定化微生物技術(shù)修復(fù)機(jī)理

金屬或類金屬的不同氧化狀態(tài)決定了它們的遷移率和毒性，所以氧化還原電位的變化是影響修復(fù)效果的一個重要因素［6］。微生物不能降解和破壞重金屬，但微生物是一種金屬固定劑，能夠通過生物吸附、生物積累和生物礦化作用來改變重金屬的理化性質(zhì)或價態(tài)來影響重金屬的遷移轉(zhuǎn)化或氧化還原沉淀反應(yīng)，從而降低其毒性［7］。

活微生物對金屬的生物吸附分為金屬與細(xì)胞壁結(jié)合和金屬離子通過膜進(jìn)行運(yùn)輸兩步［8］。微生物和它的代謝產(chǎn)物一定程度上都可以吸附轉(zhuǎn)化重金屬，不僅僅只有活細(xì)胞能夠降解重金屬，死亡菌株也可作為金屬陽離子的生物吸附劑，但可移動的堿金屬除外（例如K+）［9］。在死細(xì)胞中，細(xì)胞積累是一個被動的過程，金屬可能附著在表面分子上，死亡細(xì)胞的細(xì)胞壁可能已經(jīng)破裂，金屬與表面分子結(jié)合時有更多可用的結(jié)合位點(diǎn)［10］，這使得死亡細(xì)胞對重金屬的還原效率有可能比活細(xì)胞更快［11］。這是因?yàn)槲街饕l(fā)生在吸附和生物累積上，吸附發(fā)生在微生物與金屬接觸的最初幾分鐘，這個機(jī)制與新陳代謝無關(guān)，活細(xì)胞和死亡的細(xì)胞都可以發(fā)生；但在生物累積上，因?yàn)檫@種機(jī)制依賴新陳代謝和能量，所以死亡的細(xì)胞不能參與這一過程［12］。雖然死亡的細(xì)胞易于保存和使用，但是生物吸附和許多重金屬離子的狀態(tài)對pH 非常敏感，死亡細(xì)胞缺乏活躍的新陳代謝和pH 值的調(diào)節(jié)從而會降低吸附的效果，這也暴露了死亡的細(xì)胞在對污染物修復(fù)時相對于活細(xì)胞的缺陷。

固定化微生物技術(shù)對重金屬的修復(fù)機(jī)制主要是：

（1）微生物對重金屬的生物吸附。細(xì)胞膜所帶負(fù)電荷對重金屬自由離子所帶正電荷的靜電吸附、離子交換作用，細(xì)胞外表面進(jìn)行的絡(luò)合作用，細(xì)胞周圍形成有利于微沉淀的環(huán)境使重金屬與微生物細(xì)胞表面之間產(chǎn)生化學(xué)相互作用，金屬陽離子和微生物形成不溶性聚集體；

（2）微生物對重金屬的還原。細(xì)菌產(chǎn)生的還原酶將重金屬還原；

（3）載體材料對重金屬離子的吸附還原和離子交換作用［13-15］。總的來說，重金屬是由固定化載體和微生物聯(lián)合修復(fù)的。

2 固定化微生物的方法

根據(jù)微生物與載體間的結(jié)合方式，目前主要的固定化方式有吸附法、包埋法、交聯(lián)法、表面結(jié)合法、絮凝法以及復(fù)合固定化法等［16-18］。

2.1 吸附法

吸附法主要是依靠載體材料的物理性質(zhì)或微生物與載體之間的作用力（如氫鍵、范德華力等），該方法快速簡便、環(huán)保經(jīng)濟(jì)，是生物修復(fù)過程中常用的方法。但是載體表面的吸附是通過弱鍵的形成來實(shí)現(xiàn)的，穩(wěn)定性較弱，細(xì)胞比較容易從載體泄漏到環(huán)境中。

2.2 表面結(jié)合法

表面結(jié)合法分為表面靜電吸附法和共價結(jié)合法。表面靜電吸附與物理吸附非常相似，需要用緩沖溶液清洗載體表面，以獲得親水性表面，從而吸引帶負(fù)電的細(xì)胞或酶，這種方法微生物泄漏的概率較高。共價鍵結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)是它們足夠強(qiáng)，可以減小微生物泄漏到環(huán)境中的概率［19］，但是此方法使用的結(jié)合劑通常對細(xì)胞有毒，微生物的活力和活性多會受結(jié)合劑的影響而降低。

2.3 絮凝法

絮凝法是利用某些微生物具有自絮凝形成顆粒的特性，使微生物自固定，成為無載體的固定化技術(shù)。人工絮凝即交聯(lián)法是使用交聯(lián)劑使微生物細(xì)胞與帶兩個以上多功能團(tuán)的非水溶性交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，可用于增強(qiáng)天然不絮凝的細(xì)胞的聚集。絮凝法穩(wěn)定性好，但反應(yīng)激烈，會使細(xì)胞活性降低。

2.4 包埋法

包埋法是較常用的一種微生物固定化方法。包埋法是將微生物包覆在高聚物載體內(nèi)的固定化方法。包埋后，微生物細(xì)胞只能在載體內(nèi)移動，這可以防止細(xì)胞泄漏到環(huán)境中，但也會限制營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的交換，不適合大分子污染底物的去除。包埋法載體中的微生物在生理上是多種多樣的，與載體內(nèi)部的饑餓細(xì)胞相比，位于表面附近的細(xì)胞具有高代謝活性，生物包埋過程中最重要的參數(shù)是載體孔徑與細(xì)胞直徑的比值，在比值較大的情況下，它們可能會泄漏到環(huán)境中［20］。

2.5 封裝法

封裝與包埋非常相似，在這種方法中，固定化顆粒通過半透膜與外界環(huán)境分離，這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是對微生物保護(hù)性和截留程度較好。但是該方法使用的膜滲透性有限，而且可能會被內(nèi)部微生物破壞，在原位生物修復(fù)中很少使用這種方法。

2.6 復(fù)合固定化法

復(fù)合固定化法是將不同的固定化方法聯(lián)合使用,這種方法不僅可以使微生物有較高的活性，而且還可以提高處理污染物的性能。例如有研究表明，在對微生物進(jìn)行包埋的同時,采用交聯(lián)劑對其進(jìn)行交聯(lián)處理，不僅使微生物細(xì)胞與細(xì)胞之間彼此連接,而且提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和處理污染物的能力［21］。這種聯(lián)合的方法往往能夠克服單一方法造成的局限，使各個方法協(xié)同互補(bǔ)從而帶來更大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。

3 固定化微生物的載體

3.1 載體要求

載體是固定化微生物技術(shù)實(shí)施的基礎(chǔ)，它為微生物提供生長附著和反應(yīng)的場所。選用外源微生物時需要考慮其與本土微生物進(jìn)行營養(yǎng)元素的競爭［22］，有些載體材料還可為微生物提供營養(yǎng)元素，而且一些載體材料本身對重金屬也有一定的吸附和修復(fù)能力，載體材料的結(jié)構(gòu)性能是影響固定化微生物技術(shù)實(shí)施效果的重要因素，選擇合適的高性能的載體尤為關(guān)鍵。

為了滿足微生物和技術(shù)的需要，載體材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)：

（1）有一定的物理、化學(xué)和機(jī)械的穩(wěn)定性；

（2）具備一定的生物相容性，對微生物無毒害，不易被微生物分解，保質(zhì)期長；

（3）價格低廉，易于大批量得到或生產(chǎn)，易于處理和再生；

（4）具有優(yōu)良的傳質(zhì)性能，從流動介質(zhì)到載體中心有合適的擴(kuò)散距離，易于微生物和代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散；

（5）具有較大比表面積，高細(xì)胞質(zhì)量負(fù)荷能力，使得固定化細(xì)胞密度大。

3.2 載體種類

常用的固定化微生物載體按照其性質(zhì)可以分為有機(jī)和無機(jī)載體，按合成方式又可分為天然或合成載體。

3.2.1 天然有機(jī)載體

天然有機(jī)載體具有許多穩(wěn)定生物催化劑的官能團(tuán)，常見的有海藻酸鈉、玉米芯、硅藻土等，它們大多是食品工業(yè)的廢物，一般這類載體具有親水性、可生物降解、良好的生物相容性和廉價性等特點(diǎn)。但是這類載體對生物降解的抵抗力低，對有機(jī)溶劑敏感，并且一般只在較窄的pH 范圍內(nèi)穩(wěn)定，導(dǎo)致它們在生物修復(fù)過程中應(yīng)用性受限［16,23］。

3.2.2 合成有機(jī)載體

合成有機(jī)載體一般具有許多功能基團(tuán)，具有多樣性的特點(diǎn)。這一類載體包括聚丙烯、聚乙烯醇等。在合成過程中，載體的孔隙率、孔徑、極性和疏水性可以得到控制，此外，合成載體可以形成各種形狀（如球形、橢圓形等），而且它們?nèi)菀撰@得相對便宜［16,24］。

3.2.3 無機(jī)載體

無機(jī)載體分為天然無機(jī)載體和合成載體，這類載體具有很高的化學(xué)、物理和生物抗性，包括火山巖、多孔玻璃、陶瓷、納米顆粒等。這類載體的一個重要缺點(diǎn)是官能團(tuán)較少，與微生物結(jié)合能力較弱且不能夠?yàn)槲⑸锾峁B(yǎng)分［16,25］。

由于不同的微生物和降解的化合物對使用的載體有不同的要求，所以載體的選擇是影響生物修復(fù)過程成功的關(guān)鍵步驟?；诓牧系牟煌攸c(diǎn)，可將不同種類載體材料組合成復(fù)合載體。如有研究表明將蘆葦生物碳和海藻酸鈉（SA）、聚乙烯醇（PVA）組合成復(fù)合載體，生物碳含有大量的孔結(jié)構(gòu)和較多的含氧官能團(tuán)和胺基、磺酸基、羧基和酰胺基等基團(tuán),這使該類型載體不僅具有良好的吸附性能以及較強(qiáng)的酸堿緩沖能力從而降低了顆粒破損率,還有利于微生物的黏附和增殖［26］。新型復(fù)合載體的研究是今后固定化微生物技術(shù)研究的一個重要方向。

4 固定化微生物技術(shù)在重金屬污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用

固定化微生物技術(shù)在水處理工程領(lǐng)域較成熟，但其在污染土壤修復(fù)中的研究剛剛起步，有關(guān)固定化微生物技術(shù)在重金屬污染土壤修復(fù)中的研究多屬實(shí)驗(yàn)室研究。本文主要在以下三個方面對固定化微生物技術(shù)在土壤重金屬污染的修復(fù)應(yīng)用進(jìn)行了綜述：改良劑輔助固定化微生物修復(fù)、新型材料復(fù)合固定化微生物的固定、多菌株的共固定修復(fù)。

4.1 改良劑輔助修復(fù)

微生物對重金屬等環(huán)境的脅迫比較敏感，在運(yùn)用固定化微生物技術(shù)時通常需要添加改良劑來輔助處理污染物。有些菌株只能在低濃度下耐受重金屬脅迫［27］，這就需要添加一些改良劑來輔助菌株。生物碳、腐殖質(zhì)或堆肥方法等作為溫和的改良劑和修復(fù)方法正彌補(bǔ)了這一缺陷［28-30］。

腐殖酸能夠催化某些還原過程并吸附到微生物和土壤礦物上，而且腐殖酸能促進(jìn)微生物胞外電子轉(zhuǎn)移，在降低Cr（VI）中起關(guān)鍵作用［31］。Hou［32］研究了腐殖酸結(jié)合新型耐鉻菌QY-1 的固鉻效果，研究證實(shí)了腐殖酸對土壤本身沒有明顯的負(fù)面影響，綜合各土壤生化指標(biāo)，新型菌與腐殖酸協(xié)同對土壤生化性能的改善程度較高，對重金屬的鈍化率達(dá)到82.83%，腐殖酸較大的表面和營養(yǎng)可以為微生物的生存提供更好的保護(hù)。

許多研究已經(jīng)證明了生物碳不僅具有吸附重金屬的能力，而且可以增加碳源輸入，從而降低重金屬在土壤中的遷移率、生物利用率以及由此產(chǎn)生的毒性［28,33-35］。重金屬能夠抑制土壤微生物的生長和酶活性從而影響固定重金屬的能力，但生物碳可以恢復(fù)重金屬污染土壤中的微生物活性，改善了微生物的固碳效率，從而減輕對土壤微生物的生物毒性［36,37］。Liu［38］等人采用化學(xué)活化和微波輔助活化對生物碳進(jìn)行改性，經(jīng)活化的生物碳處理后，上層水和孔隙水的Cd 濃度分別下降71%和49%，重金屬的脅迫以及鎘的生物利用度降低。這些研究均表明活性生物碳是一種低成本效益高的固定重金屬的原位修復(fù)材料，基于這些優(yōu)點(diǎn)，生物碳為固定化微生物技術(shù)提供了一種有效的載體。

4.2 新型材料復(fù)合固定化微生物

單一的物理或化學(xué)修復(fù)有許多局限性，現(xiàn)代新型材料具有的特性和復(fù)合修復(fù)往往能夠取得更好的修復(fù)效果。納米材料由于具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)等優(yōu)勢，成為一種前景廣闊的載體材料。納米材料對重金屬也具有較好的固定化效果［39］。Tan［25］以羧甲基纖維素為穩(wěn)定劑，制備了腐殖酸包覆納米FeS，合成一種新型納米復(fù)合載體材料，然后固定抗鉻微生物菌群來處理土壤中的鉻，該處理組具有較高的酶活性，說明腐殖酸能夠促進(jìn)土壤微生物的代謝，改善土壤質(zhì)量，新型復(fù)合材料結(jié)合菌群的實(shí)驗(yàn)組對Cr（VI）固定化效率最高為99.16%，而且這種新型復(fù)合材料可以逐漸降低土壤的pH 值，提高土壤的自凈和修復(fù)能力。Peng［40］等人研究了復(fù)合鐵基納米粒子對鉛污染土壤中鉛、鐵有效性及微生態(tài)的影響，他發(fā)現(xiàn)生物碳可以改善鐵基納米顆粒的晶型和表面積，他的研究表明了納米零價鐵和生物類復(fù)合組在高濃度鉛污染堿土中的修復(fù)中具有較好效果。納米材料不能為微生物提供足夠的養(yǎng)分，而且對某些土壤微生物活性有輕微的抑制作用，但復(fù)合固定化載體的制備降低了納米材料的毒性，也可防止納米材料團(tuán)聚，提高納米材料的穩(wěn)定性，具有較好的修復(fù)潛力。

4.3 共固定微生物修復(fù)

與單一菌株相比，混合菌株能夠執(zhí)行更復(fù)雜的修復(fù)任務(wù)并在更多變的環(huán)境中生存。Kang［41］等人評估了混合細(xì)菌對鉛、鎘和銅的解脲活性和碳酸鹽沉淀能力。與單種細(xì)菌相比，該細(xì)菌混合物具有較高的生長速率、脲酶活性，混合菌對重金屬的抗性更強(qiáng)，細(xì)菌混合物表現(xiàn)出比單獨(dú)培養(yǎng)物更高的重金屬生物修復(fù)能力，這可能是由于混合培養(yǎng)物的不同菌株之間的協(xié)同效應(yīng)造成的?；旌吓囵B(yǎng)物更高的修復(fù)效率反映了微生物能夠更好地適應(yīng)由金屬毒性引起的不利環(huán)境條件，這表明混合菌是一種很有前途的修復(fù)方式，因?yàn)樯飶?qiáng)化不是針對單一物種，而是針對能夠提供更多樣性和提高去除時間和效率的微生物混合物，并且現(xiàn)實(shí)污染中，被污染的場地往往不僅僅被一種重金屬或污染物污染，混合菌的固定化性能為這一問題找到一種解決的可能方案。

5 結(jié)語

固定化微生物技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)與環(huán)境融合于污染控制的應(yīng)用，具有二次污染小，成本低，處理效率高，微生物活性高，穩(wěn)定性較強(qiáng)，抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種比較合適前景廣泛的土壤重金屬污染修復(fù)方法，但是還有許多問題亟待解決：

（1）目前還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，幾乎沒有現(xiàn)場應(yīng)用的報道，現(xiàn)階段大多數(shù)研究者對重金屬處理的實(shí)驗(yàn)是在靜態(tài)吸附情況，動態(tài)反應(yīng)器中的吸附能力研究可能會是今后的研究重點(diǎn)，另外從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向?qū)嶋H項(xiàng)目所面臨的實(shí)驗(yàn)放大問題也需要考慮。

（2）固定化微生物技術(shù)需要預(yù)先專門培養(yǎng)馴化來獲得高效能的菌種，這種方法得到的菌種其專一性很強(qiáng)，這些菌株通常只適合實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)，但實(shí)際應(yīng)用中可能會需要大量的菌株，而且一般污染物繁雜，目前的大多數(shù)研究的只是針對單一重金屬，對多種重金屬同時污染的情況研究較少，單一的針對性菌種無法做到多種污染物同時處理，尋找多功能菌株可能會是今后的研究重點(diǎn)。

（3）載體材料和固定化方法也是固定化技術(shù)高效進(jìn)行的關(guān)鍵，根據(jù)實(shí)際項(xiàng)目環(huán)境開發(fā)改良能夠容納多種菌株的新型復(fù)合載體使之共同處理不同的污染物是今后必須面對的研究重點(diǎn)。

（4）相對于傳統(tǒng)的物理化學(xué)修復(fù)方法，固定化微生物方法周期較長，尋找高效的固定化方法和菌株，使修復(fù)周期盡可能縮短也是需要考慮的一個問題。

（5）針對實(shí)際問題將傳統(tǒng)修復(fù)技術(shù)與固定化微生物技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用或許會產(chǎn)生更好的效果，這或許也是今后研究的一個主要趨勢。