潘 璠 王愛忠
常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一種單基因遺傳性腎囊性疾病,可發(fā)生于不同種族人群中。該疾病以腎臟多發(fā)囊腫為特點,患者腎臟呈進行性增大,成年后常發(fā)生腎功能衰竭。ADPKD主要由蛋白激酶D(PKD)1或PKD2基因突變引起,PKD1和PKD2突變所致的ADPKD比例分別為85%和15%。Hughes等[1]發(fā)現(xiàn)PKD1編碼的多囊蛋白(polycystin, PC)是一種具有多個跨膜結構域和1個胞質(zhì)羧基(C)端的糖蛋白,有超過2 500個氨基酸,其氨基(N)端胞外區(qū)域包含豐富的亮氨酸重復、1個C型凝集素、16個免疫球蛋白樣重復和4個Ⅲ型纖維連接蛋白相關區(qū)域;該結構決定了PC1為一種參與細胞-細胞或基質(zhì)-基質(zhì)相互作用的膜蛋白。Mochizuki等[2]發(fā)現(xiàn)PC2是PKD2基因編碼的產(chǎn)物,含有968個氨基酸序列,有6個跨膜區(qū)、細胞N端和C端。 PC1、PC2與電壓激活的鈣(鈉)通道家族具有氨基酸序列相似性,且含有潛在的鈣結合結構域。PC2可與自身、PC1或其他蛋白質(zhì)和配體結合,作為共同信號轉導途徑的一部分。Koulen等[3]通過單通道研究進一步證實,在體內(nèi)PC2作為鈣激活的細胞內(nèi)鈣釋放通道發(fā)揮作用,細胞內(nèi)局部鈣濃度的微小變化可能足以激活附近的PC2通道。這種細胞內(nèi)鈣信號通道的丟失導致了與ADPKD相關的缺陷。在非腎臟組織中,如血管平滑肌、骨骼肌、心肌細胞和神經(jīng)元的上皮細胞也表達PC1和PC2這兩種蛋白質(zhì),在胰腺、肝臟、肺、腸、腦、生殖器官、胎盤和胸腺的上皮結構中尤其顯著[4]。隨著對PC2蛋白質(zhì)的結構及功能的深入研究,越來越多的學者認為PC2作為一種非選擇性鈣離子(Ca2+)通道,通過對Ca2+信號的調(diào)控,在ADPKD的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用?,F(xiàn)對近年來PC2對Ca2+信號調(diào)控的研究進展進行綜述。
PC2是ADPKD第2種致病基因PKD2編碼的產(chǎn)物,該蛋白質(zhì)在結構上與瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)通道超家族成員高度同源[5],其N端和C端均位于細胞質(zhì)內(nèi),在跨膜結構5和6與胞內(nèi)N端和C端結構域之間的胞外環(huán)中有1個孔同源區(qū)域,以及1個假定的肌動蛋白結合(HAX)結構域。PC2的C末端包含1個螺旋結構域、假設的磷酸化位點和1個EF手結構域(用于結合Ca2+)[6]。PC2的N端結構域序列則與初級纖毛定位和形成二聚化結構相關[7]。4個PC2單體組裝成PC2四聚體形成離子通道結構,其二聚化受3個不同域的調(diào)節(jié)[8]。Shen等[9]在冷凍電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn),PC2離子滲透通路在跨膜區(qū)6的選擇性過濾器和細胞質(zhì)附近受到限制,說明有兩個通道均可調(diào)節(jié)離子轉導;而其胞外結構域是ADPKD致病突變的重點,參與通道組裝,并與跨膜核發(fā)生相互作用。Grieben等[10]的研究則進一步證實,PC2通道結構頂端為結合1種新的PC特異性的四角形開口,稱為頂部域(TOP domain),由電壓傳感器樣域(voltage-sensor-like domain ,VSLD)的兩個擴展構成,其覆蓋了通道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔或細胞外表面。當PC2在ER內(nèi)時,其位于ER腔內(nèi),當PC2在質(zhì)膜或纖毛內(nèi)時,其位于細胞外表面;而在腎小管上皮細胞中,PC2則位于腎小管腔內(nèi)。頂部域折疊在多囊蛋白中是保守的,其包括PC1的同源通道樣區(qū),并且是ADPKD相關錯義突變體簇的所在位置。頂部域、濾過孔隙和VSLD之間的廣泛接觸為物理和化學刺激調(diào)控提供了充分的空間。學者通過研究PC2結構,更深入地認識了該蛋白質(zhì)的功能與疾病調(diào)控機制。
PC2的功能與其亞細胞定位密切相關,但其定位尚存爭議。PC2主要定位于高爾基體前膜特別是ER中,其胞質(zhì)尾端的磷酸化包含ER定位信號。細胞表面生物素化檢測也表明,在上皮細胞中單獨的PC2不會運輸?shù)郊毎砻鎇11],PC2可與PC1形成通道復合物轉運至細胞膜發(fā)揮胞內(nèi)外信號轉導功能[4],或通過第5環(huán)的HAX結合位點與抗凋亡的HS1相關蛋白(HAX-1)結合參與接觸細胞基質(zhì)[12]。學者通過研究上皮細胞過表達PC2的鈣成像發(fā)現(xiàn),在ER上,肌醇1,4,5-三磷酸(InsP3)刺激表現(xiàn)出明顯的細胞內(nèi)鈣釋放信號增強,表明PC2具有Ca2+通道活性。同時,當細胞內(nèi)局部鈣濃度發(fā)生微小變化時,PC2足以在不與其他蛋白質(zhì)相互作用的情況下激活附近的通道。有研究[13]結果顯示,PC2而非PC1是原發(fā)纖毛離子通道所需亞基,并且PC2的纖毛轉運和離子通道活性與PC1無關。目前普遍認為,PC2還可在質(zhì)膜上起作用,但其活性受ER與質(zhì)膜之間的轉運、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和活化模式等復雜調(diào)控。有研究結果表明,質(zhì)膜中PC2的數(shù)量是受到與其相互作用的蛋白質(zhì)[如PC1[14-15]、高爾基體-ER關聯(lián)蛋白-14(PIGEA-14)[16]和磷酸呋喃酸簇分選蛋白(PACS)[17]]的調(diào)控。PC2還與質(zhì)膜中的其他離子通道亞基[如瞬時受體Ⅰ型電位通道(TRPC1)、瞬時感受器電位蛋白Ⅴ(TRPV4)]相互作用,最終激活細胞表面表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)[18]。總體來說,PC2可能影響Ca2+從不同的細胞間室流入,包括纖毛(纖毛質(zhì))、質(zhì)膜和ER,其功能缺失導致Ca2+信號通路失調(diào),從而導致細胞異常增殖和液體分泌相關的通路異常激活,如cAMP依賴的B-Raf/MEK/ERK級聯(lián)信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和T細胞活化核因子(NFAT)通路[19],從而導致腎囊腫的發(fā)生、發(fā)展。
多數(shù)研究已經(jīng)證實,PC1的卷曲螺旋可與PC2的C端連接形成PC復合物;如果去除PC1或PC2任何一個的C端,都將破壞這種相互作用。在腎上皮細胞中,PC2與PC1形成的復合物主要幫助PC2向質(zhì)膜及初級纖毛的轉運和定位,通過傳遞Ca2+信號以響應腎小管流體流動的變化而發(fā)揮機械傳感器功能。PC1或PC2的丟失或功能障礙均可導致細胞無法感知機械刺激,從而導致細胞形態(tài)和極性的異常,進而導致腎囊腫的形成。流體剪切應力觸發(fā)的Ca2+信號通過PC2依賴的鈣釋放在初級纖毛中啟動,結合Ryanodine受體(RyR),相同的Ca2+信號激活胞質(zhì)鈣反應,誘導Ca2+從細胞內(nèi)流入儲存[20]。PC2也能與TRPC1和TRPV4相互作用。PC2和TRPC1組裝形成與PC1無關的異源性通道,在G蛋白偶聯(lián)受體(GPR)作用下被激活,并顯示出與單個PC2和TRPC1通道不同的電導模式,無論是通過纖毛彎曲還是通過質(zhì)膜GPR的激活,PC2/TRPC1復合物的激活都可能影響纖毛相關Ca2+信號的機械傳導[21]。PC2也可與TRPV4形成異質(zhì)通道復合體,利用TRPV4介導機械性和滲透性信號。在腎衰竭發(fā)生前,PC2/TRPV4復合體即可介導多囊腎病患者全身滲透壓和血壓調(diào)節(jié)功能的損傷。一項研究[22]顯示,在腎臟集合管纖毛(陽性)細胞中,表皮生長因子(EGF)通過結合受體EGFR作用于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,刺激了TRPP2/TRPV4通道的異?;顒?,增加了Ca2+內(nèi)流,進而導致細胞增殖和囊性形成。另一項研究[23]結果則顯示,纖毛PC2依賴的通道可因去極化和細胞質(zhì)Ca2+水平升高而激活,這種活性可被瞬時電位受體通道(TRPM)3通道的激動劑(硫酸孕烯醇酮)增強,或被TRPM3通道的特異性抑制劑有效阻斷;在利用CRISPR/Cas9編輯敲除TRPM3基因后,纖毛通道消失,證明PC2可與TRPM3異源結合發(fā)揮離子通道作用。盡管多數(shù)報道認為,在初始纖毛中存在大量Ca2+通道,但Ca2+信號通路在纖毛中作為機械傳感器的作用仍有爭議。Delling等[24]在研究腎上皮細胞、腎小管、胚胎結節(jié)的冠狀細胞、內(nèi)耳毛細胞的運動神經(jīng)節(jié)和幾種細胞系的原纖毛血流響應時,未在生理或流體的超生理水平發(fā)現(xiàn)特定的Ca2+涌入纖毛。因此,各類Ca2+通道在纖毛上存在的具體作用及機制需要更深入的研究。
關于PC2在ER中的定位也存有爭議。學者通過對細胞表面蛋白質(zhì)的免疫組織化學檢測和生物素化檢測來確定內(nèi)源性和轉染的PC2的亞細胞定位發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性PC2存在于小鼠腎臟內(nèi)髓集合管(IMCD)細胞和馬丁達比犬腎(MDCK)細胞的質(zhì)膜和原纖毛中,而異源表達的PC2在ER定位中占主導地位[25-26]。這可能由PC2的C末端存在ER滯留信號,以及對內(nèi)切糖苷酶H的C化作用的高敏感性所致;當PC2單獨表達時會被滯留在ER膜。ER中的PC2被認為是一種Ca2+激活的鈣釋放通道[3],與其他兩個ER相關的Ca2+釋放通道,即InsP3受體和RyR一起參與ER內(nèi)Ca2+的調(diào)控[27]。InsP3R是位于ER的Ca2+通道,是一種大相對分子質(zhì)量的(每個亞基314 000)表達泛素的同聚四聚體。免疫共沉淀實驗結果顯示,PC2的C端與InsP3R的N端配體結合域(LBD)上的一簇帶正電的氨基酸緊密結合,部分抑制了InsP3與LBD的結合。PC2與InsP3R之間的相互作用是一種互惠共生關系,在InsP3刺激ER內(nèi) Ca2+釋放后,這種相互作用建立一個含有高水平Ca2+的信號微域。通過PC2激活Ca2+誘導Ca2+釋放,這種PC2與InsP3R的相互作用有助于解釋為何在PC2 C端截斷突變體R742X及點突變體D511V中觀察到的Ca2+瞬變的半衰減時間(t1/2)沒有改變的現(xiàn)象;這是由于PC2 C端尾部的酸性團簇的丟失,使PC2與InsP3R的相互作用被破壞,禁止了Ca2+信號微域的形成,從而抑制了激活PC2誘導的Ca2+的釋放。此外,雖然D511V可以與InsP3R發(fā)生物理作用,但PC2通道本身功能的失活可抑制Ca2+通過ER膜[28-30]。另外,InsP3R與PC2的相互作用還與ER中PC1的水平有關,PC2與基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)競爭結合InsP3R,高水平PC1可通過增強InsP3R/STIM1的結合,減少PC2與InsP3R之間的聯(lián)系,從而導致ATP-Ca2+信號的減少[31];相反地,PC2的突變導致STIM1/InsP3R結合增多,抑制存儲Ca2+內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)。因此,與野生型細胞相比,TRPP2缺陷型膽管細胞的細胞質(zhì)和ER內(nèi) Ca2+水平和SOCE降低或減少[32]??傮w來說,PC2和InsP3R似乎通過干擾正常的Ca2+信號在ADPKD的發(fā)展中發(fā)揮作用。在三維細胞培養(yǎng)中,被敲除PC2的腎臟細胞會出現(xiàn)囊腫。而敲除InsP3R 1型和3型也可導致細胞囊腫的發(fā)生,其特點是體積更大,細胞死亡增加、進一步發(fā)生分化[33]。
RyR是一種位于肌質(zhì)網(wǎng)(SR)/ER的細胞內(nèi)Ca2+釋放通道,從細胞內(nèi)存儲釋放Ca2+,激活肌肉收縮和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[34]。RyR2是心肌主要的Ca2+釋放通道,與PC2的N端和C端胞質(zhì)區(qū)與RyR2 結合[35]。有趣的是,在封閉狀態(tài)下,RyR2與PC2末端的130~220氨基酸相互作用,但不與PC2 C末端相互作用;然而,當維持在開放狀態(tài)時,RyR2與PC2的N和C 端結合。PC2 N端似乎對于PC2/RyR關聯(lián)是必要的,而C端則以Ca2+依賴的方式降低RyR2的開放率[35]。PC2的這種調(diào)節(jié)作用解釋了PKD2缺失小鼠心肌細胞肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+自發(fā)振蕩頻率增加和Ca2+含量減少的現(xiàn)象。斑馬魚和小鼠心肌細胞的功能研究測試了PC2調(diào)節(jié)RyR2的必要條件,證明PC2功能障礙引起Ca2 +異常傳導,導致心輸出量減少和鈣-收縮偶聯(lián)受損,降低心率和每搏輸出量,縮短心室動作電位,增加房室傳導阻滯的發(fā)生率。PC2對不同血管床的肌源性反應有不同的調(diào)節(jié)作用,PC2主要位于人和大鼠大腦動脈平滑肌細胞膜上,在腸系膜動脈和主動脈則位于ER或SR膜上。在剝離的主動脈環(huán)和腸系膜動脈中,當毒胡蘿卜素預處理使得Ca2+耗盡時,PC2組與對照組大鼠的血管收縮程度無顯著差異。上述結果表明,在激動劑誘導的血管收縮方面,位于ER膜的PC2可能比位于細胞膜的PC2更重要。 這也進一步解釋了ADPKD患者在疾病后期除了出現(xiàn)腎功能的改變外,還常伴有心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的潛在原因。
如上所述,Ca2+信號通路的失調(diào)和Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞是ADPKD發(fā)生、發(fā)展的重要原因。因此,恢復細胞內(nèi)Ca2+水平可作為治療ADPKD的一種有效手段;如雷公藤甲素的臨床前試驗已經(jīng)取得了顯著的成果[36]。雷公藤甲素是一種具有活性的二萜化合物,通過PC2機制誘導細胞內(nèi)Ca2+的釋放。這種分子治療通過恢復ADPKD模型小鼠Ca2+信號轉導和細胞增殖抑制了囊腫的擴大,改善小鼠腎功能。然而,亦有回顧性研究[37]結果表明,與未經(jīng)治療的患者相比,使用CCB治療ADPKD患者的腎小球濾過率降低,從而導致腎功能的進一步損傷。此外,鈣化模擬物(如R-568)是鈣敏感受體的變構活化劑,用R-568處理PKD2-/WS25ADPKD模型小鼠,對囊腫的發(fā)生無明顯影響[38];但近期研究[39]發(fā)現(xiàn),R-568處理PKD1缺陷細胞可使細胞線粒體Ca2+水平接近野生型細胞內(nèi)Ca2+水平,并完全逆轉了與PC1通道中斷相關的細胞能量的損失。盡管目前依賴于Ca2+通道調(diào)節(jié)劑的治療效果仍有爭議,但相關研究路徑值得堅持,以期發(fā)現(xiàn)更有效的藥物或治療方案。
Ca2+信號通過參與大量細胞內(nèi)的信號轉導來調(diào)節(jié)廣泛的病理生理學過程。Ca2+信號在基因表達、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸傳遞、肌肉收縮、代謝、增殖等方面具有重要作用。Ca2+信號轉導是一個復雜的生理學過程,而PC2作為一種非選擇性的Ca2+釋放通道,其功能的失活將導致細胞內(nèi)外Ca2+信號的失控而激發(fā)一系列細胞功能紊亂,如對細胞凋亡的敏感性增加[40],促進細胞增殖從而導致腎囊腫的發(fā)生、發(fā)展。目前,對PC2的功能研究多集中在ADPKD疾病的研究方面,事實上PC2作為一種普遍存在的應激敏感蛋白質(zhì),其表達在響應細胞應激時上調(diào),以防止多種疾病誘導的細胞病理性死亡[41]。因此,針對PC2在腎臟系統(tǒng)的致病機制應展開更為深入的研究。