楊雅靜, 汪耘吉, 馮尚勇

(1.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院, 遼寧 大連, 116000; 2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 江蘇 揚州, 225001)

甲狀腺結(jié)節(jié)(TN)的診斷需要綜合病史、臨床表現(xiàn)、超聲特征、穿刺細胞學(xué)、實驗室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)等綜合判斷，其中超聲引導(dǎo)下的甲狀腺細針穿刺(US-FNA)是國內(nèi)外TN診治指南推薦的主要診斷方法之一，廣泛應(yīng)用于臨床。但有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)US-FNA存在約5%的假陽性率和5%的假陰性率，約30%的標本無法明確其病理性質(zhì)。目前，已進入分子診斷及精準治療時代，細針穿刺(FNA)標本相關(guān)的基因檢測可準確對細胞學(xué)不確定的TN進行病理性質(zhì)評估，提高診斷的準確率[3]。本文就幾種常見的分子標志物對TN診斷及預(yù)后評估相關(guān)研究的進展進行綜述。

1 基因突變和重排

1.1 BRAFV600E基因突變

B型RAF激酶屬于RAF家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，并且是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑最有效的激活劑，該蛋白在細胞增殖、分化和凋亡中具有重要作用。研究[4-5]表明約50%至80%的甲狀腺乳頭狀癌(PTC)發(fā)生BRAFV600E突變，其被視為PTC特異性的分子標志物。BRAFV600E在其他類型的甲狀腺癌，如甲狀腺濾泡狀癌(FTC)和Hürthle細胞癌，很少甚至不發(fā)生突變[6]。文獻[7]表明BRAFV600E突變在PTC診斷中具有高度特異性，陽性突變可以避免細胞學(xué)診斷為不確定結(jié)節(jié)的兩階段手術(shù)(即診斷性腺葉切除術(shù)后的甲狀腺全切除)，但其診斷靈敏度存在爭議。一項薈萃[8-9]分析發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變對FNA診斷不確定組的診斷靈敏度僅有60%，對改善細胞學(xué)的診斷準確性無意義。但最近的一項研究[8-10]發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變聯(lián)合FNA檢查的靈敏度達98.4%, 準確率為98.1%。此外，相關(guān)研究表明BRAFV600E突變被視為PTC預(yù)后不良的標志物，與甲狀腺癌的包膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較高等不良結(jié)局密切相關(guān)，可作為PTC復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測因子。XING M等[11]通過納入1 849名PTC患者分析BRAFV600E突變與PTC患者死亡率的相關(guān)性，結(jié)果表明帶有BRAFV600E突變的PTC患者的死亡率更高。

盡管BRAFV600E突變在PTC中具有高度特異性，但是其診斷靈敏度存在爭議，且僅與PTC關(guān)系密切，因此BRAFV600E突變分析應(yīng)作為輔助手段與細胞學(xué)、影像學(xué)相結(jié)合，以明確TN性質(zhì)[4, 8]。

1.2 RAS基因突變

RAS突變是FNA標本中檢測到的另一常見突變類型，目前共發(fā)現(xiàn)HRAS、NRAS和KRAS三種亞型，RAS基因編碼的GTP/GDP結(jié)合蛋白參與MAPK及phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)/protein kinase B(AKT)途徑中的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，在傳遞細胞生長分化信號方面起重要作用。該基因突變將導(dǎo)致RAS胞內(nèi)信號過度活躍，細胞不可控制地增殖、惡變。報道[12-13]指出NRAS和HRAS突變預(yù)測甲狀腺腫瘤具有更高的陽性預(yù)測值(PPV), 并且與KRAS突變相比，其濾泡變異型甲狀腺乳頭狀癌(FVPTC)的關(guān)系更為密切。KRAS突變與嗜酸性細胞病變相關(guān)，發(fā)生此突變的結(jié)節(jié)惡性率更低。

GUAN H等[14]通過觀察僅RAS突變的惡性結(jié)節(jié)12例患者，發(fā)現(xiàn)其均無腺外擴散、淋巴結(jié)及血管浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，且術(shù)后隨訪期間也無復(fù)發(fā)，證明RAS突變可作為甲狀腺癌的預(yù)后指標，提示低風(fēng)險癌。一項隨訪時間為8.3年的研究[15]表明所有攜帶RAS突變的細胞學(xué)良性結(jié)節(jié)均表現(xiàn)為惰性生長。美國甲狀腺學(xué)會建議，對于RAS突變陽性的結(jié)節(jié)行腺葉切除術(shù)。RAS突變多見于濾泡型腫瘤，包括濾泡型腺瘤(FTA)、FTC以及 FVPTC等。目前尚不清楚RAS突變陽性的細胞學(xué)良性結(jié)節(jié)是否有癌變的可能。最近一項薈萃分析[16]顯示, RAS突變在被細胞學(xué)診斷為不確定結(jié)節(jié)的惡性腫瘤中有高達93.5%的特異性，但敏感性僅為34.3%, PPV為78.0%。因此單一檢測RAS突變作為甲狀腺惡性腫瘤的預(yù)測指標意義不大，研究指出RAS突變與其他遺傳標記物的結(jié)合具有更高的PPV。

1.3 RET基因突變

RET原癌基因負責(zé)編碼屬于一種受體酪氨酸激酶的跨膜蛋白，參與的信號通路包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路，與細胞生存、增殖密切相關(guān)。當RET基因發(fā)生突變或重排，激活RET基因，并可能編碼出具有異?；顒拥腞ET蛋白，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)異常生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與進展。早期有報道提出RET/PTC重排是PTC中發(fā)現(xiàn)的最常見遺傳改變，是其特有的標記物。RET重排至少有13種, 90%以上的重新排列是RET/PTC1和RET/PTC3。相關(guān)研究[17-18]報道顯示，不同類型的RET/PTC可能與PTC的不同臨床病理特征有關(guān)，RET/PTC1在典型的PTC或微小乳頭狀癌中更常見且預(yù)后更佳; 而RET/PTC3則與侵襲性腫瘤的關(guān)系更密切，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，在兒童或暴露于電離輻射的PTC患者中發(fā)生更頻繁。但有研究[19]對RET/PTC重排是PTC的特異性遺傳改變提出質(zhì)疑，指出RET/PTC重排也發(fā)生在濾泡性腺瘤和橋本氏甲狀腺炎等非惡性腫瘤性結(jié)節(jié)中。RET點突變可導(dǎo)致甲狀腺濾泡細胞惡變，其是遺傳型甲狀腺髓樣癌(MTC)的發(fā)病基礎(chǔ)，可在98.3%的遺傳型MTC和6.2%的散發(fā)型MTC中發(fā)現(xiàn)RET突變, RET點突變對于MTC篩查具有重要的參考價值，對于攜帶該突變的人群，應(yīng)進行密切隨訪或預(yù)防性手術(shù)治療[20，21]。WANG S等[22]提出RET點突變與MTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且為MTC靶向分子治療提供了強有力的依據(jù)。

由于檢測方法、地域差異、輻射暴露史及腫瘤的組織亞型不同, PTC中RET/PTC重排的發(fā)生率差異很大，且RET/PTC重排在良性結(jié)節(jié)中也可見。因此，對FNA標本單獨行RET/PTC重排的診斷性檢測并不可靠。

1.4 PAX8/PPARγ重排

PAX8/PPARγ重排是指PAX8編碼區(qū)2q13斷裂點與 PPARγ 編碼區(qū) 3q13 斷裂處融合形成。該種染色體易位將導(dǎo)致具體致癌機制尚未明確的致癌性PAX8/PPARγ融合蛋白(PPFP)產(chǎn)生。PAX8/PPARγ重排最初發(fā)現(xiàn)于FTC和FTA患者中，被認為是FTC中最常見的融合基因[23]。有研究[23-25]顯示，在FTC中，PAX8/PPARγ重排的陽性表達率在30%～63%, 在FTA中可達55%, 尚未在良性或惡性的嗜酸性細胞瘤中檢測到此類重排的表達[25]。ARMSTRONG M J等[25-27]提出在PTC患者中也能檢測出PAX8/PPARγ重排，但大都歸類于FVPTC, 與FTC的組織病理學(xué)和生物學(xué)特性相似，好發(fā)于青年人，腫瘤的體積小，伴血管浸潤，但是其組織分化及預(yù)后良好，無淋巴結(jié)累及和向甲狀腺周圍組織浸潤傾向。有研究[23]發(fā)現(xiàn)PAX8/PPARγ重排在FTA中的表達明顯低于FTC，這種突變可高度提示發(fā)生高分化的甲狀腺癌，有助于FNA標本的濾泡性癌與濾泡性腺瘤(良性)的鑒別診斷，有利于避免良性結(jié)節(jié)行手術(shù)及惡性腫瘤漏診的發(fā)生，并減少患者負擔(dān)。

1.5 P53基因突變

P53基因是實體腫瘤的一種抑制基因，研究[28]證明在近半數(shù)的惡性腫瘤中該基因發(fā)生突變。DWIVEDI S S等[28]發(fā)現(xiàn)惡性TN中P53基因突變檢出率(85.29%)顯著高于良性結(jié)節(jié)(29.35%), 其診斷良惡性結(jié)節(jié)的準確率達76.88%?，F(xiàn)有文獻[29]發(fā)現(xiàn)P53基因突變在甲狀腺未分化癌的檢出率高達50%～80%, 而在PTC和FTC的檢出率分別為40%和22%, 且主要發(fā)生在PTC和FTC更具侵襲性的組織學(xué)亞型中，P53基因突變與甲狀腺腫瘤的去分化密切相關(guān)。ZHANG J等[30]對50例甲狀腺濾泡性腫瘤進行分子檢測，發(fā)現(xiàn)P53基因突變與癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并提出其為甲狀腺癌預(yù)后不良的指標。P53基因突變?yōu)榈头只谞钕侔┑饶[瘤相關(guān)的靶向治療提供了新方向。

1.6 TERT啟動子突變

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是端粒酶的催化亞基，可通過在染色體的末端加上端粒，對保持染色體長度和基因序列的穩(wěn)定性起重要作用。端粒酶活化是腫瘤形成的關(guān)鍵，當TERT啟動子發(fā)生突變時，激活端粒酶進而導(dǎo)致細胞癌變。研究[31-32]發(fā)現(xiàn)TERT啟動子突變存在于各種甲狀腺癌中，甲狀腺未分化癌等高侵襲性腫瘤的基因表達率更高，而甲狀腺正常組織及良性甲狀腺腫瘤通常罕見表達。研究[32-33]表明TERT突變與患者發(fā)病年齡較大、甲狀腺癌的腺外侵犯、血管侵襲、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期升高顯著有關(guān)，該基因突變有望成為甲狀腺癌的診斷及預(yù)后指標。

1.7 TERT與其他基因突變共存

研究[34-35]表明, TERT啟動子突變與BRAFV600E突變對甲狀腺癌的不良預(yù)后有協(xié)同效應(yīng)，同時攜帶2種突變的患者復(fù)發(fā)率及死亡率顯著上升，其腫瘤侵襲性相比任意單獨基因突變的患者更高。此外，報道[32]顯示TERT啟動子突變率與BRAFV600E突變率呈相互促進關(guān)系。有研究[36]闡明了協(xié)同作用的機制: 一方面，機體存在BRAFV600E突變時，通過激活MAPK途徑并上調(diào)ETS轉(zhuǎn)錄因子，與TERT啟動子突變產(chǎn)生的ETS結(jié)合位點結(jié)合，增加TERT的表達和端粒酶活性; 另一方面, TERT啟動子突變可進一步激活與炎癥、癌變等相關(guān)的分子通路。與BRAFV600E作用相似，RAS突變通過優(yōu)先激活PI3K/AKT信號通路，與TERT啟動子突變共存時，協(xié)同作用甲狀腺癌的預(yù)后，導(dǎo)致腫瘤的侵襲性增高。因此，對TN進行TERT突變聯(lián)合BRAFV600E突變或RAS突變檢測，具有較高的預(yù)后評估價值。

2 基因表達檢測方法

2.1 多分子聯(lián)合檢測

盡管單個遺傳標志物具有較高的特異性，但其敏感性低，限制了單個基因標志物檢測在細胞學(xué)不確定TN的臨床應(yīng)用。研究表明多個基因標記物組合診斷將顯著提高診斷準確率。在分化型甲狀腺癌中最常見的基因包括: BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, RET/PTC1, RET/PTC3和PAX8/PPARγ。一項前瞻性研究[3]表明多基因檢測在細胞學(xué)診斷不確定的結(jié)節(jié)中有87%～95%的高陽性預(yù)測值，并提出可有助于醫(yī)生選擇準確的手術(shù)方式，對于該組合中的任何基因陽性突變應(yīng)行甲狀腺全切除術(shù)。

2.2 Afirma基因表達分類器

Afirma基因表達分類器(GEC)是一種通過檢測167個基因轉(zhuǎn)錄物的表達來診斷TN性質(zhì)的檢測方法。相關(guān)薈萃分析[37]顯示，GEC的總敏感性為95.5%, 特異性為22.1%, 陰性預(yù)測值(NPV)為88.2%, PPV為44.3%, 由于其具有高度的敏感性及NPV，認為其屬于一種“排除性方法”，可以高效的從不確定的TN中識別出良性結(jié)節(jié)，從而降低醫(yī)療成本。一項研究[37]通過總結(jié)GEC檢測后的術(shù)后病理結(jié)果指出，大多數(shù)在手術(shù)后具有良性病理結(jié)果的是濾泡性腺瘤(31.2%), 良性濾泡性結(jié)節(jié)(15.6%)和腺瘤樣結(jié)節(jié)(13.0%), 并提出必須結(jié)合其他分子標記物來提高檢測GEC的特異性。GEC檢測主要局限于其特異性低，且檢測為良性的結(jié)節(jié)缺乏長期隨訪評估和組織病理學(xué)診斷，因此其特異性與預(yù)測值相比會降低，敏感性會增高[38-39]。另外一個局限性在于嗜酸性細胞腫瘤的惡性風(fēng)險相對較低，但大多數(shù)均呈GEC陽性，導(dǎo)致GEC檢測的假陽性增加[40]。

2.3 二代測序

二代測序(NGS)的發(fā)展，闡明了甲狀腺癌的分子發(fā)病機制，且僅需極少量的核酸就能同時在大型基因組中進行多基因突變的靶向檢測，該技術(shù)對現(xiàn)有基因突變組合進行了擴展(包括其他基因突變、融合和易位，以及microRNA基因表達組)。

NIKIFOROVA M N等[41]基于NGS提出對甲狀腺惡性腫瘤診斷密切有關(guān)的12種基因的284個突變位點進行檢測，發(fā)現(xiàn)145個惡性腫瘤中有110個發(fā)生突變, 83個良性結(jié)節(jié)中僅有5個檢測出突變，表明NGS具有高度敏感性和診斷準確性。NIKIFOROV Y E等[42]開發(fā)了ThyroSeqV2，能同時檢測甲狀腺癌中13種基因的點突變和42種基因融合，具有90%的敏感性和95%的特異性, PPV和NPV分別為83%和96%, 證明ThyroSeqV2能同時具有較高NPV和PPV，不僅檢測效果較優(yōu)，還能幫助有高風(fēng)險的惡性結(jié)節(jié)患者選擇適當?shù)氖中g(shù)。一項回顧性研究[43]指出，ThyroSeqV2的PPV在各項研究中差異很大。最近的ThyroSeqV3研究表明其可檢測112個與廣泛的惡性腫瘤(包括Hürthle細胞癌)有關(guān)的各種基因的點突變、基因融合、拷貝數(shù)改變及基因表達改變。一項多中心前瞻性研究[44]顯示ThyroSeqV3的敏感性為94%, 特異性為82%, PPV和NPV分別為66%和97%，可避免高達61%的不確定結(jié)節(jié)患者過度治療，并提供陽性結(jié)節(jié)的分子特征，幫助臨床進一步給予個體化治療。

3 小 結(jié)

目前尚未發(fā)現(xiàn)任何單一的分子標志物對甲狀腺惡性腫瘤具100%的特異性。因此仍需要多中心、前瞻性的具有長期隨訪數(shù)據(jù)的研究，尋找靈敏度和特異性均較優(yōu)的標志物，為甲狀腺惡性腫瘤的早期篩查、預(yù)防、診斷、預(yù)后評估及基因靶向治療提供方向。