陳駿良， 池楊峰， 寧鳳玲， 王 利， 吳曉涵， 臧贏君，陳 靜， 張雪梅， 王 浩

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院腎臟內科，上海 200062； 2. 復旦大學藥學院，上海 201203)

水腫是腎病綜合征(nephrotic syndrome, NS)的常見臨床表現(xiàn)，近年來研究認為腎臟集合管上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel, ENaC)激活所致原發(fā)性鈉潴留是引起NS水腫的重要致病機制[1-3]。ENaC由α、β、γ 3個亞基組成，其在集合管頂膜上的表達量是決定通道活性的重要因素，并與腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)密切相關[4]。AMPK可使泛素連接酶Nedd4-2發(fā)生磷酸化，增強其與ENaC間的結合作用，促使ENaC發(fā)生泛素化并被細胞內吞降解，最終導致ENaC膜表達量下降，該AMPK/Nedd4-2/泛素化通路是調控ENaC活性的重要機制[5-7]。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為水腫的形成與正氣不足、氣水失運有關，益氣扶正是水腫的重要治法。黃芪湯始載于北宋《仁齋直指方論》，由黃芪、茯苓、麥門冬、五味子、生地黃、瓜蔞根和炙甘草七味藥組成，有益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪之效，本課題組在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)該方可有效改善NS水腫，但其現(xiàn)代藥理學機制尚不明確。根據既往研究基礎[8-11]，推測黃芪湯對NS水腫的治療機制可能在于其可激活AMPK/Nedd4-2/泛素化通路，從而抑制ENaC活性，減輕水鈉潴留?；谠摽茖W假設，本課題組研究了黃芪湯對小鼠腎皮質集合管上皮細胞(M-1細胞)ENaC的干預作用及AMPK/Nedd4-2/泛素化通路在其中的調控效應，初步闡明了黃芪湯利水作用的藥理機制，為改善NS水腫的臨床療效提供了研究基礎和啟示。

1 材料與方法

1.1 黃芪湯提取物的制備

黃芪湯方劑組成(g)： 黃芪20、茯苓20、麥門冬20、五味子10、生地黃30、瓜蔞根20和炙甘草10。加4倍量水，熱回流提取2h后過濾，擠干濾渣內水分，再重復上述流程2次。合并所有提取液，減壓濃縮為稠浸膏，以95%乙醇調節(jié)含醇量為70%，靜置過夜。吸取上清液，105℃減壓干燥48h，得黃芪湯干粉提取物。稱取適量經渦旋、超聲和水浴后充分溶解于細胞培養(yǎng)基中，經0.22μm濾器過濾并配制成所需濃度的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

M-1細胞購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)；人胚腎293T細胞購自中國中喬新舟公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；地塞米松、抗ENaCβ抗體購自美國Sigma公司；DMEM/F12購自上海源培生物科技股份有限公司；聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)購自美國Polysciences公司；聚凝胺(polybrene)和嘌呤霉素購自上海翊圣生物科技有限公司；細胞膜蛋白提取試劑盒、辣根過氧化物酶標記的小鼠和兔二抗、小鼠非特異性IgG抗體、MG-132購自中國碧云天生物技術有限公司；抗ENaCα抗體購自美國Thermo Fisher公司；抗ENaCγ抗體、抗p-Nedd4-2抗體、抗NaK ATPase抗體、抗泛素抗體購自美國Abcam公司；抗AMPKα1抗體、抗p-AMPKα1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；抗Nedd4-2抗體、Protein A/G瓊脂糖珠購自美國Santa Cruz公司；抗α-tubulin抗體購自美國Proteintech公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和分組

M-1細胞在37℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境下復蘇、培養(yǎng)、傳代于含5%胎牛血清、5μmol/L地塞米松的DMEM/F12中。將細胞分為空白對照組和黃芪湯組，后者予以0.1、0.3或1.0mg/mL 的黃芪湯溶液預孵24h。在研究AMPK的作用機制時，部分M-1細胞預先進行了短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)干擾以抑制AMPK的表達。

1.4 方法

1.4.1 構建AMPK敲減的M-1細胞系 設計合成特異性識別小鼠AMPK-α1基因的shRNA慢病毒質粒。慢病毒載體質粒為pGLV2-U6-puro，shRNA靶標序列如下。shRNA1： 5′-GCACGAGTTGACCGGAC-ATAA-3′；shRNA2： 5′-GCTGTGGCTCACCCAATTA-TG-3′；shRNA3： 5′-GCGTGTACGAAGGAAGAATCC-3′。引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。用PEI將shRNA慢病毒質粒(pMD2.G)和輔助包裝質粒(psPAX2)共轉染至人胚腎293T細胞中，72h后收集培養(yǎng)基上清液，16000×g超濾離心10min以獲得慢病毒濃縮液。M-1細胞接種至6孔板中，待細胞融合密度為30%左右，更換為不含血清、青/鏈霉素的培養(yǎng)基，加入聚凝胺5μg/mL和慢病毒濃縮液20μL/孔，6h 后換液。細胞傳代，用嘌呤霉素2μg/mL 篩選，并用Western印跡法驗證細胞內AMPK-α1的表達水平，以建立AMPK-α1敲減和陰性對照的穩(wěn)定細胞株。

1.4.2 Western印跡法 對于細胞質蛋白，用裂解液(1% NP-40,50mmol/L Tris pH 7.4, 1mmol/L EDTA, 150mmol/L NaCl, 50mmol/L NaF, 10mmol/L焦磷酸鈉, 10mmol/L甘油磷酸酯)裂解細胞，16000×g離心10min取上清液；用細胞膜蛋白提取試劑盒提取細胞膜蛋白。蛋白定量，加入SDS上樣緩沖液，95℃加熱5min后上樣行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后轉膜，之后以含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉30min。加入抗ENaCα、ENaCβ、ENaCγ、AMPKα1、p-AMPKα1、Nedd4-2、p-Nedd4-2、α-tubulin或NaKATPase等一抗(1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的小鼠或兔二抗，室溫孵育1h。TBST洗膜3次后以ECL化學發(fā)光法顯影，用Image LabTM圖像采集和分析軟件(Bio-Rad，美國)進行成像分析。

1.4.3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) Protein A/G瓊脂糖珠使用前均經過裂解液預清洗3次。裂解細胞，800×g離心5min取上清液，蛋白定量。各組取1.5mg蛋白，先加入小鼠非特異性IgG抗體和瓊脂糖珠，4℃孵育30min以清除非特異性雜蛋白，800×g離心5min取上清液。加入抗Nedd4-2抗體，4℃孵育過夜后加入瓊脂糖珠，4℃ 繼續(xù)孵育2h。800×g離心5min，棄去上清液，用裂解液清洗瓊脂糖珠5次，加入SDS上樣緩沖液，95℃加熱5min 后800×g離心5min取上清液，并以Western印跡法進行ENaC檢測。泛素化檢測時，細胞培養(yǎng)基中預先加入MG132 10μmol/L以抑制蛋白降解，處理4h后收集細胞，用抗泛素抗體和瓊脂糖珠進行Co-IP，余同前述。

1.5 統(tǒng)計學處理

以GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組之間采用獨立樣本t檢驗，多組之間采用One-way ANOVA單因素方差分析，并根據方差齊性選擇Tukey法或Tamhane法進行組間兩兩比較。P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 黃芪湯可下調ENaC的膜表達水平

隨著黃芪湯濃度由0.1mg/mL增至1.0mg/mL，ENaC各亞基的膜表達量呈劑量依賴性下降趨勢，其中ENaCα在黃芪湯1.0mg/mL時、ENaCβ在黃芪湯0.3、1.0mg/mL時與空白對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A及圖1C～E。與膜表達量不同，隨著黃芪湯濃度上升，ENaC的全細胞表達量未見同步下降，ENaCα和ENaCβ在部分濃度時反較空白對照組有所升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B及圖1F～H。進一步分析ENaC的膜/全細胞表達比，ENaCα、ENaCβ在黃芪湯各濃度時均顯著低于空白對照組，ENaCγ在黃芪湯1.0mg/mL 時也顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1I～K。上述結果顯示，黃芪湯1.0mg/mL對ENaC膜表達水平的下調作用最強，故選定該值作為統(tǒng)一藥物濃度進行后續(xù)研究。

2.2 黃芪湯促進AMPK和Nedd4-2的磷酸化激活

在上述結果的基礎上，推測黃芪湯抑制ENaC膜表達的作用機制可能與其對AMPK/Nedd4-2/泛素化通路的調控效應有關。進一步的檢測顯示，黃芪湯組的AMPK和Nedd4-2水平與空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義，磷酸化AMPK(p-AMPK及其總體占比)和磷酸化Nedd4-2(p-Nedd4-2及其總體占比)水平則均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。提示黃芪湯確實具有促進AMPK和Nedd4-2磷酸化激活的作用。

2.3 黃芪湯激活AMPK以活化Nedd4-2，抑制ENaC的膜表達

為進一步證實黃芪湯通過AMPK/Nedd4-2/泛素化通路對ENaC膜表達的調控機制，我們基于shRNA干擾技術構建了AMPK-α1敲減的穩(wěn)轉細胞系。檢測顯示3個shRNA敲減試驗組中，shRNA1和shRNA3的M-1細胞AMPK表達量均顯著低于空白對照組和陰性對照(negative control, NC)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。證實敲減系構建成功，其中shRNA1的敲減效果最好，故選為實際應用組，設為shRNA組，該組細胞加用黃芪湯1.0mg/mL孵育24h后設為shRNA+黃芪湯組。

圖1 黃芪湯對ENaC表達水平的影響作用(n=3)Fig.1 The effect of Huangqi decoction on ENaC expression(n=3)A： Western印跡法示各組ENaC膜表達量；B： Western印跡法示各組ENaC全細胞表達量；C～E： 各組ENaC膜表達量比較；F～H： 各組ENaC全細胞表達量比較；I～K： 各組ENaC膜/全細胞表達量比值比較；與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與黃芪湯0.1mg/mL組相比，#P<0.05，##P<0.01

圖2 黃芪湯對AMPK和Nedd4-2的影響作用(n=3)Fig.2 The effect of Huangqi decoction on AMPK and Nedd4-2(n=3)A： Western印跡法示AMPK、Nedd4-2及其磷酸化水平；B～D： AMPK及其磷酸化水平比較；E～G： Nedd4-2及其磷酸化水平比較；與空白對照組相比，**P<0.01，***P<0.001

圖3 shRNA敲減AMPK的效果驗證(n=3)Fig.3 Examination of AMPK knockdown by shRNA interference (n=3)A： Western印跡法示各組AMPK表達量；B： 各組AMPK表達量比較； 與空白組相比，***P<0.001；與NC組相比,#P<0.05，###P<0.001

在ENaC各亞基的膜表達量上，shRNA組均較空白對照組呈升高趨勢，其中ENaCα的增幅明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而shRNA組和shRNA+黃芪湯組間的差異均無統(tǒng)計學意義，見圖4A及圖4C～E。在全細胞表達量上，除shRNA+黃芪湯組的ENaCβ小幅高于shRNA組外(P<0.05)，ENaC各亞基在三組間的差異均無統(tǒng)計學意義，見圖4B及圖4F～H。進一步分析ENaC膜/全細胞表達比，shRNA組的ENaC各亞基較之空白對照組仍呈升高趨勢，但尚未達顯著水平，同時shRNA組和shRNA+黃芪湯組間的差異也均無統(tǒng)計學意義，見圖4I～K。Nedd4-2水平在三組間均無顯著性差異；磷酸化Nedd4-2水平在shRNA組和shRNA+黃芪湯組間無顯著性差異，但均顯著低于空白對照組(P<0.05)，見圖5。

圖4 AMPK敲減后黃芪湯對ENaC表達水平的影響作用(n=3)Fig.4 The effect of Huangqi decoction on ENaC expression after AMPK knockdown (n=3)A： Western印跡法示ENaC膜表達量；B： Western印跡法示ENaC全細胞表達量；C～E： 各組ENaC膜表達量比較；F～H： 各組ENaC全細胞表達量比較；I～K： 各組ENaC膜/全細胞表達量比值比較；與空白組相比，*P<0.05；與shRNA組相比, #P<0.05

圖5 AMPK敲減后黃芪湯對Nedd4-2的影響作用(n=3)Fig.5 The effect of Huangqi decoction on Nedd4-2 after AMPK knockdown (n=3)A： Western印跡法示Nedd4-2及其磷酸化水平；B～D： 各組Nedd4-2及其磷酸化水平比較；與空白組相比，***P<0.001

2.4 黃芪湯激活AMPK以增強Nedd4-2與ENaC的結合作用，促進ENaC泛素化

Co-IP檢測顯示，黃芪湯組ENaCγ與Nedd4-2的結合作用高于空白對照組，且隨著黃芪湯濃度由0.1mg/mL增至1.0mg/mL呈劑量依賴性增長；ENaCα、ENaCβ與Nedd4-2的結合作用則在各濃度下與空白對照組間均無明顯差異，見圖6A～C。AMPK敲減后，shRNA組ENaC各亞基與Nedd4-2的結合作用均低于空白對照組；shRNA+黃芪湯組ENaCγ與Nedd4-2的結合作用較之shRNA組無明顯變化，而ENaCα、ENaCβ與Nedd4-2的結合作用則高于shRNA組，見圖6D～F。

泛素化檢測顯示，黃芪湯組ENaCα、ENaCβ的泛素化水平均高于空白對照組，且呈劑量依賴性增長；ENaCγ的泛素化水平隨黃芪湯濃度增加也呈進行性升高，雖然在黃芪湯0.1mg/mL和0.3mg/mL時其泛素化水平低于空白對照組，但在1.0mg/mL時仍高于空白對照組，見圖7A～C。AMPK敲減后，shRNA組ENaC各亞基的泛素化水平均不同程度低于空白對照組，其中ENaCγ尤為明顯；shRNA+黃芪湯組的ENaCγ泛素化水平較之shRNA組無明顯變化，而ENaCα、ENaCβ的泛素化水平則仍高于shRNA組，見圖7D～F。

圖6 黃芪湯對ENaC和Nedd4-2間結合作用的影響Fig.6 The effect of Huangqi decoction on the interaction between ENaC and Nedd4-2 A～C： 黃芪湯各濃度下ENaC和Nedd4-2的結合作用(Co-IP)；D～F： shRNA敲減AMPK對ENaC和Nedd4-2結合作用的影響(Co-IP)

圖7 黃芪湯對ENaC泛素化水平的影響作用Fig.7 The effect of Huangqi decoction on ubiquitination of ENaC A～C： 黃芪湯各濃度下ENaC的泛素化水平(Co-IP)；D～F： shRNA敲減AMPK對ENaC泛素化水平的影響(Co-IP)

3 討 論

水腫是NS的常見臨床表現(xiàn)，經典理論多以“低灌注假說”來解釋其發(fā)病機制[12]，而近年來的研究則發(fā)現(xiàn)NS時蛋白尿還可通過腎內原發(fā)機制直接引起鈉潴留，導致有效血容量增加和水腫形成，其核心環(huán)節(jié)是腎臟集合管的ENaC激活[1-3,13]。在ENaC的3個亞基中，ENaCγ含有纖溶酶的剪切位點，主司通道開閉。NS時腎小球濾過膜受損，原尿中纖溶酶異常增多，可通過蛋白剪切作用去除ENaCγ上的抑制性肽段，導致通道激活并促進水鈉潴留發(fā)生[14]。ENaC在集合管頂膜上的表達量是決定通道活性的重要因素，其與AMPK的調控作用密切相關[4]。AMPK是細胞的“能量代謝感受器”，在營養(yǎng)代謝、炎癥反應和水鈉調節(jié)中發(fā)揮著重要的生理作用。多項研究顯示，AMPK可使E3泛素連接酶Nedd4-2的Ser-328位點發(fā)生磷酸化，增強其WW模體與ENaC各亞基胞內域PPxY模體間的結合作用，促使ENaC發(fā)生泛素化并被細胞內吞轉運至溶酶體降解，從而導致其膜表達量下降、活性受抑[5-7,15]。AMPK/Nedd4-2/泛素化通路是調控ENaC活性的重要機制。

中醫(yī)經典理論認為水腫形成與正氣不足、氣水失運有關，因此益氣扶正是水腫的重要治療方法。我科常用方黃芪湯始載于北宋楊士嬴的《仁齋直指方論》卷十七，方中黃芪益氣固表、利水消腫；茯苓利水滲濕、健脾和胃；麥門冬滋陰生津、清心除煩；五味子收斂固澀、補腎寧心；生地黃清熱生津、滋陰養(yǎng)血；瓜蔞根清熱潤肺、消腫排膿；炙甘草益氣補中、調和諸藥。諸藥合而成方，有益氣扶正之功，并兼具養(yǎng)陰之效，可生精化氣，對NS水腫具有良好的改善作用。我科室團隊長期致力于黃芪湯的現(xiàn)代藥理學研究，發(fā)現(xiàn)該方及其活性成分之一黃芪甲苷Ⅳ具有抑制足細胞凋亡、改善腎間質纖維化、保護內皮細胞功能、延緩糖尿病腎病進展等多種生物學效應[10-11，16-21]。在此基礎上，本研究進一步對黃芪湯改善NS水腫的藥理機制進行了深入探索，結果顯示，黃芪湯可顯著提升M-1細胞AMPK和Nedd4-2的磷酸化激活水平，并可下調ENaC膜表達的絕對量和相對比例；AMPK敲減后，黃芪湯對Nedd4-2和ENaC的影響作用顯著減弱，甚至趨于消失，說明AMPK是黃芪湯上述生物學效應的重要介導因子。進一步的Co-IP檢測顯示，黃芪湯可增強ENaC與Nedd4-2的結合作用及其泛素化水平，AMPK敲減后，黃芪湯對ENaCγ的上述效應明顯減弱，而對ENaCα、ENaCβ的作用則基本不受影響，提示ENaC的γ亞基很可能是黃芪湯上述效應的主要作用位點。既往研究業(yè)已證實AMPK/Nedd4-2/泛素化通路激活可抑制ENaC膜表達，故結合本研究結果，綜合提示黃芪湯可通過激活AMPK以促進Nedd4-2磷酸化，增強Nedd4-2與ENaC的結合作用，導致后者發(fā)生泛素化降解、膜表達量下降，從而抑制其通道活性，這可能構成了該方利水作用的現(xiàn)代藥理學機制。此外，本研究顯示AMPK敲減后，Nedd4-2的磷酸化激活受抑，其與ENaC的結合作用以及后者的泛素化水平下降，而ENaC膜表達則呈上升趨勢，這一結果也符合既往研究已證實的AMPK/Nedd4-2/泛素化通路對ENaC活性的調控規(guī)律。

既往研究[6]顯示，生理狀態(tài)下，AMPK激活Nedd4-2后，ENaCβ是與Nedd4-2結合的主要亞基，同時ENaCγ也可能少量參與了該結合過程。而本研究則發(fā)現(xiàn)，與生理狀態(tài)下的機制不同，黃芪湯激活AMPK后，ENaC與Nedd4-2結合的主要位點可能位于γ亞基上。這說明黃芪湯對ENaC的藥理作用并非生理狀態(tài)下機制的簡單放大，而是可能牽涉到包括靶亞基轉移在內的其他獨特機制，值得進一步深入研究。當然，無論Nedd4-2的結合亞基是ENaCβ還是ENaCγ，其都是ENaC必不可少的組成部分，無論何者發(fā)生泛素化降解，都會使ENaC無法形成完整、穩(wěn)定的膜蛋白，從而導致ENaC其他亞基的膜表達量也同步下降，這也與本研究的結果相符。

作為腎臟負責水鈉轉運的核心通道之一，ENaC活性除受AMPK調控外，還受到其他諸多因素的影響，其中最經典的是醛固酮/血清和糖皮質激素調節(jié)蛋白激酶1(serum-and glucocorticoid-induced protein kinase 1, SGK1)/泛素化通路和血管加壓素/蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)/泛素化通路。醛固酮和集合管細胞胞質內的鹽皮質激素受體結合后，一方面該復合體可發(fā)生核轉位并激活ENaC基因的轉錄、轉譯，從而直接增加ENaC的蛋白合成；另一方面其還可促進SGK1的合成，后者磷酸化Nedd4-2的位點(Thr-246為主，Ser-328次之)和效應與AMPK不盡相同，能降低Nedd4-2和ENaC的親和力，抑制ENaC泛素化，從而上調ENaC的膜表達水平[2，7，22]。除醛固酮外，血管加壓素也是參與機體水鈉調節(jié)的重要激素，其與集合管細胞基膜側的V2R受體結合后，可激活PKA，發(fā)揮類似于SGK1的作用，抑制Nedd4-2與ENaC的結合，從而增加ENaC的膜表達量[4,23]。由此可知，SGK1、PKA雖然也作用于Nedd4-2，但其與AMPK的效應正相反，雙方互相拮抗平衡，對ENaC形成了雙向調控。本研究目前聚焦于黃芪湯調節(jié)AMPK以影響ENaC的作用機制，其中shRNA抑制AMPK后黃芪湯對Nedd4-2的磷酸化激活雖顯著受抑，但仍有微弱上升趨勢，這一方面可能在于shRNA對AMPK系敲減而非徹底敲除、致使殘留AMPK仍可微弱激活Nedd4-2，另一方面也不排除存在SGK1、PKA代償性激活Nedd4-2的可能。在后續(xù)研究中，須進一步拓展評估黃芪湯對醛固酮/SGK1、血管加壓素/PKA通路等ENaC調節(jié)網絡中其他要素的作用效應，從而更全面地闡明黃芪湯調控ENaC活性的完整機制圖譜。

綜上所述，本研究顯示黃芪湯可通過激活AMPK/Nedd4-2/泛素化通路以下調ENaC的膜表達水平，從而抑制其活性，這可能構成了該方利水作用的現(xiàn)代藥理學機制。