王藝靜， 高文霞， 石凱燕， 施佳玉， 孫 毅,2

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化中心，上海 200065)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem/stromal cells, MSCs)是成體干細(xì)胞的一種，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層[1]，可從骨髓[2]、脂肪組織[3]、臍帶[4]、羊水[5]等分離獲得。MSCs因具有免疫調(diào)節(jié)作用，在自身免疫性疾病、炎癥、腫瘤等疾病的治療領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[6]。

目前，有不少研究致力于提高M(jìn)SCs的免疫調(diào)節(jié)能力，從而優(yōu)化治療效果。其中，對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理是一種較為簡(jiǎn)單的方法。常見的預(yù)處理方法有炎癥因子預(yù)處理[7]和缺氧/低氧預(yù)處理[8]。但是關(guān)于炎癥因子預(yù)處理MSCs對(duì)其免疫調(diào)節(jié)能力的影響，尚存在諸多爭(zhēng)議。有研究表明，炎癥因子如IFN-γ預(yù)處理MSCs，可以增強(qiáng)其免疫抑制特性，減輕炎癥反應(yīng)[9]。但也有研究顯示，IFN-γ和TNF-α聯(lián)合預(yù)處理的MSCs引起結(jié)腸炎小鼠模型疾病的惡化[10]。因此，闡明炎癥因子調(diào)節(jié)MSCs免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，有利于MSCs應(yīng)用于炎癥性疾病的臨床治療。IFN-γ是一種常見的炎癥因子，可由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生，包括激活的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11-14]。本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中GSE77814芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，旨在探究IFN-γ預(yù)處理對(duì)MSCs轉(zhuǎn)錄組的改變，同時(shí)比較了不同濃度IFN-γ預(yù)處理的區(qū)別，深入揭示了炎癥因子IFN-γ調(diào)節(jié)MSCs免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，為炎癥因子預(yù)處理對(duì)其免疫調(diào)節(jié)能力的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 來源

從GEO數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE77814骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[15]。該芯片所用的平臺(tái)為GPL13497 Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2(Probe Name version)。選取其中9例對(duì)照組的數(shù)據(jù)分別與3例IFN-γ(6.5ng/mL，低濃度組)預(yù)處理48h、3例IFN-γ(65ng/mL，高濃度組)預(yù)處理48h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 差異基因的獲取

使用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的GEO2R(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)的R語言程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析，剔除未知基因及非編碼RNA。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)<0.05且|logFC|≥1為差異基因(differentially expressed genes, DEGs)篩選條件，對(duì)IFN-γ-H DEGs中上調(diào)和下調(diào)變化最大的前15位基因做熱圖。

1.3 差異基因的GO富集分析和KEGG富集分析

對(duì)IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs分別采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析(Gene Ontology，http：∥geneontology.org/)，采用KEGG Mapper(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， https：∥www.kegg.jp/)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.4 Uniprot蛋白數(shù)據(jù)分析

利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：∥www.uniprot.org/)對(duì)IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs中上調(diào)的基因所編碼的蛋白分別進(jìn)行細(xì)胞亞定位的分析。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(https：∥string-db.org/)對(duì)IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs中上調(diào)的基因分別構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPI network)，置信度為0.4。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用cytoHubba插件計(jì)算度值(degree)，以此作為關(guān)鍵靶基因的篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 GSEA富集分析

由于一代富集分析方法如GO富集分析和KEGG富集分析是對(duì)篩選后的差異基因進(jìn)行分析，存在遺漏其他重要基因的弊端。因此，這里使用二代富集分析方法GSEA 4.0.3(Gene Set Enrichment Analysis)對(duì)mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，旨在提供更全面的分析結(jié)果。以MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲得基因集c2.cp.kegg.v7.0.symbols作為參照基因集，設(shè)定富集基因集的范圍為15～500個(gè)基因，隨機(jī)組合重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次，尋找預(yù)處理后差異顯著的基因及其富集的通路。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因分析

以FDR<0.05且|logFC|≥1為差異基因篩選條件。IFN-γ低濃度組與未處理組相比，共篩選出152個(gè)差異基因，其中133個(gè)為上調(diào)基因，19個(gè)為下調(diào)基因。IFN-γ高濃度組與未處理組相比，共篩選出648個(gè)差異基因，其中431個(gè)為上調(diào)基因，217個(gè)為下調(diào)基因。可以看出，IFN-γ高濃度處理?xiàng)l件下產(chǎn)生的差異基因幾乎包含了低濃度處理?xiàng)l件下產(chǎn)生的差異基因，且高濃度處理產(chǎn)生的差異基因數(shù)目更多，各差異基因組別之間有重疊關(guān)系，見圖1、表1～3。該結(jié)果表明，IFN-γ的濃度對(duì)MSCs轉(zhuǎn)錄組的影響較大。此外，趨化因子(如CXCL9、CCL8)和經(jīng)典的抑炎因子IDO-1在高濃度的IFN-γ處理下才出現(xiàn)較高的表達(dá)。圖2為高濃度組處理下上調(diào)和下調(diào)差異倍數(shù)最大的15個(gè)基因的熱圖。

圖1 差異基因的Circos圖Fig.1 The Circos plot of DEGsCircos圖中，紫色的線連接相同的基因，藍(lán)色的線連接富集于相同本體條目的基因；該圖在Metascape平臺(tái)(http：∥www.metascape.org/)繪制完成

2.2 GO富集分析結(jié)果

IFN-γ-L DEGs的分析結(jié)果顯示，這些基因共參與105種生物學(xué)過程、35種細(xì)胞組分和32種分子功能。其中，F(xiàn)DR<0.01的生物學(xué)過程有20種、細(xì)胞組分有12種、分子功能有3種。絕大多數(shù)影響的生物學(xué)過程都與免疫相關(guān)，“免疫反應(yīng)”富集的基因數(shù)目最多(n=34,FDR為3.14×10-20)；“IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路”最為顯著(n=30,FDR為1.94×10-41)。這些基因影響了多種細(xì)胞組分，主要集中于細(xì)胞生物膜系統(tǒng)。顯著影響的分子功能只有3個(gè)條目： 肽抗原結(jié)合、MHC Ⅱ類分子受體活性和抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(transporter associated with antigen processing 1, TAP 1)結(jié)合。IFN-γ-H DEGs的分析結(jié)果顯示，這些基因共參與177種生物學(xué)過程、43種細(xì)胞組分和49種分子功能。其中，F(xiàn)DR<0.01的生物學(xué)過程有19種、細(xì)胞組分有7種、分子功能有2種。富集的條目與IFN-γ-H DEGs的富集結(jié)果接近。圖3列出了對(duì)生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能影響最顯著的前10項(xiàng)GO條目(若有)。

表1 IFN-γ-L DEGs上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的前10個(gè)基因

表2 IFN-γ-L DEGs下調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的10個(gè)基因

表3 IFN-γ-H DEGs上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的10個(gè)基因

表4 IFN-γ-H DEGs下調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的10個(gè)基因

圖2 IFN-γ高濃度組上調(diào)和下調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的前15名基因熱圖Fig.2 Top 15 up-regulated and down-regulated gene expression of IFN-γ (high concentration) heat map

圖3 差異基因的GO富集分析Fig.3 GO analysis for DEGsA： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs；藍(lán)色代表生物學(xué)過程，綠色代表細(xì)胞組分，紅色代表分子功能

2.3 KEGG富集分析結(jié)果

分析結(jié)果顯示，IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs主要參與免疫、感染相關(guān)的信號(hào)通路，如單純皰疹病毒Ⅰ型感染、EB病毒感染、抗原處理與遞呈、流感病毒A等。此外，IFN-γ-H DEGs的富集結(jié)果中出現(xiàn)了代謝通路，且是富集數(shù)目最多的。

圖4 差異基因的KEGG富集分析Fig.4 KEGG analysis for DEGsA： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs

圖5 上調(diào)差異基因表達(dá)蛋白的分布情況(前5位)Fig.5 Proteins classified by cellular components (top 5)A： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs

2.4 Uniprot分析結(jié)果

對(duì)上調(diào)差異基因利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)胞亞定位分析。IFN-γ-L DEGs的133個(gè)上調(diào)基因中，132個(gè)有蛋白注釋。IFN-γ-H DEGs的431個(gè)上調(diào)基因中，427個(gè)有蛋白注釋。這些蛋白絕大多數(shù)屬于生物膜系統(tǒng)，與2.2利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO細(xì)胞組分富集分析的結(jié)果相一致。由于MSCs行使免疫調(diào)節(jié)功能與旁分泌作用密切相關(guān)，本研究對(duì)差異基因所編碼的分泌型蛋白進(jìn)一步分析。低濃度處理?xiàng)l件下產(chǎn)生的分泌型蛋白對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)差異最大的前5位為TNFSF13B、OAS1、SECTM1、TNFSF10、IL18BP；而高濃度處理?xiàng)l件下的前5位為CXCL9、GBP1、CCL8、SCTM1、OAS1。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

圖6和圖7分別為IFN-γ-L DEGs和IFN-γ-H DEGs中上調(diào)表達(dá)的差異基因所構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。圖8揭示了兩組分別篩選得到的前10位hub基因(顏色越偏向紅色代表該靶蛋白的度值越大)。

圖6 上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(IFN-γ-L DEGs)Fig.6 PPI network of up-regulated IFN-γ-L DEGs

圖7 上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(IFN-γ-H DEGs)Fig.7 PPI network of up-regulated IFN-γ-H DEGs

圖8 關(guān)鍵靶基因圖Fig.8 PPI network of hub genesA： IFN-γ-L DEGs；B： IFN-γ-H DEGs

2.6 GSEA富集分析結(jié)果

以FDR<25%且標(biāo)準(zhǔn)化的P<0.05的基因集為陽性基因集，炎癥因子預(yù)處理后富集最顯著的前10項(xiàng)結(jié)果見表5～6。高濃度預(yù)處理組和低濃度預(yù)處理組富集最顯著的KEGG信號(hào)通路都是自身免疫性甲狀腺疾病，見圖9。

表5 IFN-γ低濃度預(yù)處理后富集的KEGG 信號(hào)通路及相關(guān)數(shù)據(jù)

表6 IFN-γ高濃度預(yù)處理后富集的KEGG 信號(hào)通路及相關(guān)數(shù)據(jù)

圖9 自身甲狀腺疾病的富集分析結(jié)果及相關(guān)基因集(IFN-γ低濃度處理)Fig.9 GSEA analysis for autoimmune thyroid disease and positively enriched associated molecules(low concentration of IFN-γ treatment)

3 討 論

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)炎癥因子IFN-γ處理(6.5ng/mL，48h；65ng/mL，48h)和未處理組的芯片數(shù)據(jù)，利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以FDR<0.05且|logFC|≥1為差異基因篩選條件，后續(xù)對(duì)編碼已知mRNA的差異基因進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)原作者Jin等[15]主要關(guān)注IFN-γ和TNF-α聯(lián)合預(yù)處理對(duì)MSCs轉(zhuǎn)錄組水平的影響，并未深入分析IFN-γ預(yù)處理對(duì)MSCs的影響。雖然作者指出IFN-γ和TNF-α具有協(xié)同作用，但有研究表明，IFN-γ對(duì)MSCs免疫應(yīng)答的影響占據(jù)主要部分[16]，因此有必要深入闡明IFN-γ所發(fā)揮的作用。此外，原作者將不同濃度的炎癥因子預(yù)處理的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果混合分析。盡管相比于不同種類的炎癥因子刺激，炎癥因子的濃度差異影響較小，但仍不可忽略。目前，關(guān)于IFN-γ的預(yù)處理濃度與MSCs免疫調(diào)節(jié)能力之間的關(guān)系較少，且背后分子機(jī)制的研究仍處于空白。因此，本研究從轉(zhuǎn)錄組水平揭示了不同濃度的IFN-γ預(yù)處理對(duì)MSCs基因表達(dá)水平的影響，以期為炎癥因子預(yù)處理對(duì)MSCs影響的研究進(jìn)行補(bǔ)充。

本研究中，IFN-γ低濃度組與未處理組相比，共篩選出152個(gè)差異基因，其中133個(gè)為上調(diào)基因，19個(gè)為下調(diào)基因。IFN-γ高濃度組與未處理組相比，共篩選出648個(gè)差異基因，其中431個(gè)為上調(diào)基因，217個(gè)為下調(diào)基因。該結(jié)果表明，炎癥因子對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組具有較大影響且機(jī)制復(fù)雜，并且與炎癥因子處理濃度有密切關(guān)系。

IFN-γ-L DEGs中，上調(diào)表達(dá)差異最大的基因主要和免疫相關(guān)，如MHC I類和MHC Ⅱ類相關(guān)分子、白介素相關(guān)基因。其中，有些基因會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，如CD74和GBP5。CD74是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migra-tion inhibitory factor, MIF)的特異性受體，與MIF結(jié)合后，可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，如p38MAPK，促進(jìn)炎癥因子的釋放[17]。GBP5可以促進(jìn)炎性小體的組裝和活化，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[18]。IFN-γ高濃度預(yù)處理使趨化因子和抑炎因子的表達(dá)量大大提升。在炎癥因子的刺激下，細(xì)胞的信號(hào)通路會(huì)產(chǎn)生變化。KEGG富集的結(jié)果顯示，無論是低濃度組還是高濃度組，IFN-γ都主要影響和免疫、抗感染等相關(guān)的通路。而對(duì)IFN-γ-H DEGs的富集分析結(jié)果顯示，代謝通路富集到的基因數(shù)目最多，提示高濃度的IFN-γ預(yù)處理可能對(duì)MSCs代謝產(chǎn)生較大的影響。有研究表明，IFN-γ預(yù)處理MSCs能使其代謝方式從原來的線粒體呼吸(mitochondrial respiration)轉(zhuǎn)化為有氧糖酵解(aerobic glycolysis)。這種代謝方式的轉(zhuǎn)換使得MSCs的代謝能力增強(qiáng)，提升了其促炎因子如PGE2的釋放水平，從而轉(zhuǎn)化為免疫抑制表型[19]。以血清剝奪的方式預(yù)處理48h，MSCs的能量代謝也會(huì)從氧化磷酸化為主轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒鉃橹鳎⑸险{(diào)糖異生相關(guān)的酶的表達(dá)。這種代謝方式的轉(zhuǎn)變有助于移植的MSCs在惡劣微環(huán)境中的存活，并能提高其免疫抑制能力[20]。因此，炎癥因子對(duì)MSCs細(xì)胞代謝的影響，以及MSCs細(xì)胞代謝與免疫調(diào)節(jié)功能之間的關(guān)系，有待進(jìn)一步闡明。

MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力受微環(huán)境影響很大[21]。盡管不少體外研究證實(shí)了MSCs具有良好的免疫抑制作用，但體內(nèi)研究的結(jié)果并不十分明朗，可能與體內(nèi)微環(huán)境不同有關(guān)。體內(nèi)微環(huán)境的炎癥因子水平在不同疾病及不同個(gè)體中往往不盡相同。2014年，Wang等[22]提出MSCs的免疫調(diào)節(jié)具有可塑性的觀點(diǎn)，其能根據(jù)微環(huán)境的變化轉(zhuǎn)化為促炎型MSCs或抑炎型MSCs。在急性炎癥期時(shí)，高濃度的炎癥因子會(huì)刺激MSCs釋放大量抑炎因子如IDO-1和趨化因子，從而抑制炎癥反應(yīng)。而在有低水平的炎癥因子暴露下，MSCs則表現(xiàn)出促炎的表型[23]。本研究的分析結(jié)果也與其相符。此外，炎癥因子刺激時(shí)間也會(huì)影響MSCs的免疫應(yīng)答。MSCs在IFN-γ刺激后短時(shí)間內(nèi)，會(huì)大量上調(diào)表達(dá)MHC分子，導(dǎo)致免疫原性升高，容易產(chǎn)生異體排斥。但隨著刺激時(shí)間增加，MSCs能夠自主下調(diào)表面MHC分子表達(dá)，降低免疫原性[24]。近年來，MSCs分泌的胞外囊泡(MSC-EVs)引起很大關(guān)注。胞外囊泡攜帶親本細(xì)胞來源的生物活性分子及基因調(diào)控信息，能通過與細(xì)胞直接接觸或被細(xì)胞內(nèi)吞后釋放效應(yīng)分子而影響受體細(xì)胞的功能，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊[25]。已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs分泌的胞外囊泡能影響多種免疫細(xì)胞，在修復(fù)組織損傷、抑制局部炎癥和調(diào)節(jié)免疫中發(fā)揮重要作用[26-28]。由于其為生物活性物質(zhì)而非活體細(xì)胞，因此可控性較強(qiáng)，容易制訂生產(chǎn)管理方案，療效也較穩(wěn)定，避免了MSCs存在的受微環(huán)境影響而展現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)可塑性的問題，有望代替MSCs發(fā)揮生物學(xué)功能。

綜上，炎癥因子預(yù)處理對(duì)MSCs的免疫應(yīng)答能夠產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，因此要全面考慮炎癥因子種類、濃度、處理時(shí)間等不同所產(chǎn)生的差異。