劉敬天義，何培娟，董芳芳，陳申申，姚火春，潘子豪

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/世界動物衛(wèi)生組織豬鏈球菌病參考實驗室，江蘇 南京 210095)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種重要的人畜共患病病原，在世界范圍流行，對生豬養(yǎng)殖業(yè)和人的健康都帶來嚴重威脅[1]。根據(jù)莢膜多糖的抗原成分不同，將豬鏈球菌分成29個血清型(1～19，21，23～25，27～31和1/2)以及1個Chz型和20個NCL型[2]，其中2型和9型在臨床分離中較為多見，豬鏈球菌致病機制和毒力因子的研究多見于2型。細菌感染動物后出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)，如敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎，嚴重時會導(dǎo)致多器官衰竭造成死亡[3]。2005年四川省暴發(fā)豬鏈球菌并造成215人感染，38人死亡[4]。世界范圍內(nèi)已有4例豬鏈球菌1型感染人的報道[5]，國內(nèi)出現(xiàn)2例[6-7]，應(yīng)引起足夠的重視。由于豬鏈球菌1型的分離菌株較少，對該血清型的基因組分析數(shù)據(jù)有限。本研究從發(fā)病的仔豬氣管中分離出1株鏈球菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為豬鏈球菌1型，并對其開展致病性試驗以及基因組測序分析。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

病料取自廣東省某生豬養(yǎng)殖場暴發(fā)肺炎的患病豬，采集瀕死斷乳仔豬和育成豬的肝臟、肺臟和關(guān)節(jié)囊液用于病原分離，共45份樣品。

1.2 實驗動物

AB純系斑馬魚購自南京夫子廟明海水族館，5周齡SPF級BALB/c小鼠購自南京青龍山動物繁殖場。動物試驗在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心[許可批號：SYXK(SU)2017—00071]進行。

1.3 主要試劑

THB粉末(Todd—Hewitt broth)購自美國BD公司；無菌綿羊血購自江蘇省疾控中心；抗生素購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；全基因組DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司； 2×RapidTaqMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細菌的分離與鏡檢

無菌采集瀕死豬的肝臟、肺臟、關(guān)節(jié)囊液等組織樣品，用接種環(huán)劃線接種于含5%綿羊血的THB平板，倒置在CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取疑似豬鏈球菌菌落進行革蘭染色鏡檢。

1.4.2 豬鏈球菌種屬特異性及血清型鑒定

參考實驗室先前研究和相關(guān)文獻[8]，選擇豬鏈球菌特異基因recN以及血清型1型特異性片段csp1I進行PCR鑒定，引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成，引物情況詳見表1。使用全基因組提取試劑盒提取該分離菌株的基因組，對recN和cps1I基因擴增。PCR程序：96 ℃ 預(yù)變性5 min；96 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 擴增基因及引物序列

1.4.3 斑馬魚攻毒

參照文獻[9]，將該分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=0.6)，離心收集菌體后用PBS重懸，重復(fù)3次。設(shè)置3個梯度，分別為1×108、 1×107和1×106CFU/mL，各稀釋濃度接種12尾斑馬魚，每尾在泄殖腔注射10 μL菌液，用PBS作為陰性對照。持續(xù)觀察1周，每天觀察記錄斑馬魚死亡情況，用Reed-Muench公式計算半數(shù)致死量(LD50)。

1.4.4 基因組的測序與組裝

使用全基因組提取試劑盒提取該分離株的全基因組，所得基因組經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及Qubit定量檢測，大小及濃度均合格后送往上海凌恩生物科技有限公司測序。利用高通量測序技術(shù)進行基因組測序，使用ABySS和GapCloser完成拼接和gap的填充。

1.4.5 基因組組分的預(yù)測

GeneMarkS軟件檢索編碼基因；使用RNAmmer-1.2和tRNAscan-SE 2.0.4軟件對基因組中包含的rRNA與tRNA進行預(yù)測；使用IslandViewer預(yù)測基因島。毒力基因和耐藥基因使用VFDB(Virulence Factors Database)與ARDB(Anti-biology Resistance Database)數(shù)據(jù)庫對比匹配和注釋；基因毒力島登錄IslanderPath-DIOMB(www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/resources.php)基于不同GI島預(yù)測方法對測序菌株的GI島序列預(yù)測，并以圈圖的形式表現(xiàn)其在基因組上分布情況。

1.4.6 比較基因組分析

比較基因組的分析主要包括：核心與特異基因、基因組同源性和基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹等。使用 Mauve 軟件對樣本基因組和參考基因組進行基因組比對，采用 PhyML的方法，利用 MUSCLE構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。參考菌株見表2。

表2 主要參考菌株信息及其來源

2 結(jié)果

2.1 菌落鏡檢

在1 000倍光學(xué)顯微鏡下見革蘭染色呈藍紫色的短鏈狀球菌，每鏈6～12個菌，也有呈雙球或單個散在分布(圖1)；在綿陽血平板上出現(xiàn)α溶血環(huán)，菌落呈圓形、灰白色點狀、針尖大小，表面光滑，邊緣整齊，半透明。

圖1 分離菌株鏡檢(×100)

2.2 血清型鑒定

使用2對引物recN-F、recN-R和cps1I-F、cps1I-R擴增全基因組后得到的產(chǎn)物，分別在336 bp(圖2A)和153 bp處出現(xiàn)條帶(圖2B)，鑒定分離菌株為豬鏈球菌1型，并命名為SS2011GZ。

M. DNA Marker；1. 陰性對照;2. 目的片段圖2 recN基因(A)與cps1I基因(B)電泳

2.3 斑馬魚攻毒

斑馬魚在接種SS2011GZ菌株24 h內(nèi)陸續(xù)發(fā)生病變，腹部、肛門周圍出現(xiàn)充血、水腫。3 d之內(nèi)，所有接種的斑馬魚全部死亡(圖3)。根據(jù)Reed-Muench法，計算LD50為4.09×104CFU。

圖3 攻毒斑馬魚的存活曲線

2.4 基因組分析

2.4.1 全基因組序列基本信息

經(jīng)過組裝、糾正、成環(huán)檢驗后，得到完整的成環(huán)的SS2011GZ基因組，全長2 658 332 bp，GC比占39.74%，含2 692個開放閱讀框，編碼蛋白占比87.3%，48個tRNA，9個5S rRNA，1個16S rRNA，2個23S rRNA，存在19個基因島，提示該菌基因的多樣性(圖4)。

注：Integrated軟件(黑色)比較IslandPick(灰色)預(yù)測的基因島共線性分析圖4 SS2011GZ的基因島預(yù)測

2.4.2 耐藥基因分析

通過基因組測序，共發(fā)現(xiàn)24個耐藥基因，提示該菌高度耐藥。部分耐藥基因?qū)Χ喾N抗生素都存在抗性，故統(tǒng)計得到各個抗生素耐藥基因個數(shù)為：四環(huán)素類10個，大環(huán)內(nèi)酯類10個，利福霉素11個，頭孢菌素類9個，喹諾酮類12個，多肽類14個，氨基糖苷類3個，林可酰胺類3個，硝基咪唑類3個，甲砜霉素類5個，詳見表3。

表3 耐藥性基因

2.4.3 毒力基因分析

有研究表明，谷氨酸脫氫酶(gdh)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白結(jié)合蛋白(fbps)和表面抗原(sao)為豬鏈球菌的毒力因子[10]。SS2011GZ屬于mrp+gdh+epf+sly+fbps-sao-型。

2.4.4 基因組與核心基因比較分析

利用Mauve軟件對SS2011GZ的基因組與ST1、GZ0565、98HAH33、D9進行比較，結(jié)果顯示SS2011GZ在基因組之間出現(xiàn)大規(guī)模的基因重排、倒位、插入、缺失(圖5)，并且值得注意的是ST1與SS2011GZ同為1型菌，GZ0565發(fā)源地為廣州與SS2011GZ相同，兩菌與SS2011GZ的共線性極差。此外，通過比對該菌與ST1和GZ0565的特殊基因數(shù)發(fā)現(xiàn)，SS2011GZ有807個獨特基因(圖6)，提示該菌基因的復(fù)雜性和時間上呈演化趨勢。

注：相同顏色表示相似的基因片段圖5 豬鏈球菌SS2011GZ的共線性分析

圖6 菌株SS2011GZ與ST1和GZ0565的特殊基因比較

2.4.5 SS2011GZ群體進化分析

為方便研究，Tettelin等[11]在2005年曾提出過微生物的泛基因組概念。泛基因組指某一物種所有基因的總和，由核心基因組和非必需基因組組成。其中，核心基因組表示同一物種所有菌株都含有的基因，往往是必不可少的，因此可用于系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。與核心基因組相對的是非必需基因，表示僅在某株菌中或某幾株菌中存在。豬鏈球菌的泛基因組的數(shù)量隨著基因組的數(shù)目增多而不斷增大，屬于開放型泛基因組(圖7A)。而核心基因組隨著菌株數(shù)量的增多而逐漸減少，在達到17株左右時核心基因組的數(shù)量趨于穩(wěn)定，數(shù)量約在1 200至1 300個之間(圖7B)。將NCBI上公布序列的20株菌與SS2011GZ基于豬鏈球菌核心基因制作成系統(tǒng)進化樹(圖8)，進化樹結(jié)果表明SS2011GZ屬于獨立分支，提示該菌基因的獨特性。

圖7 SS2011GZ的核心基因組和泛基因組

注：▲為本試驗分離株圖8 基于核心基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患病，在豬群中傳播較廣，尤其在國內(nèi)養(yǎng)殖場更為普遍，通過食物或是直接接觸的方式，該病可由豬直接傳播給人，引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生問題。2015年，廣東省豬鏈球菌陽性率為82.02%，1型菌的檢出率只有1.07%[12]。本研究分離并鑒定該菌株為豬鏈球菌1型強毒株，相關(guān)報道較少。

斑馬魚攻毒的試驗結(jié)果顯示該菌的LD50為4.09×104CFU，與濮俊毅等[9]報道的豬鏈球菌2型強毒株HA9801(1.85×104CFU)和ZY05722(2.98×104CFU)毒力相近。目前雖沒有標(biāo)志的毒力因子來區(qū)分豬鏈球菌毒力的強弱，但國內(nèi)外公認的主要毒力因子有mrp、epf、sly、gdh、fbps等[13]。SS2011GZ屬于mrp+gdh+epf+sly+fbps-sao-型，強毒株05ZYH33和98HAH12屬于mrp+gdh+epf+sly+fbps+sao+型[14]。3株菌株都具有毒力因子mrp、gdh和sly，這3個毒力因子往往用作鑒定豬鏈球菌的毒力[15]。sao是疫苗的靶位點，該菌不具備。fbps參與致病菌黏附宿主細胞的過程[16]，敲除后毒力有所下降[17]，SS2011GZ雖然沒有該基因，但就斑馬魚半數(shù)致死量來看，其毒力應(yīng)引起人們重視。在國內(nèi)外報道過的豬鏈球菌1型感染人并造成死亡的案例中，貴州造成死亡的菌株毒力基因型為mrp-epf+sly+[7]，值得注意的是SS2011GZ屬于mrp+epf+sly+型，結(jié)合斑馬魚攻毒試驗，證實該菌毒力較強，有感染人的風(fēng)險?；虿町愂嵌玖Σ町惡湍退幉町惖母?，通過比較同地區(qū)或同血清型菌株基因組之間的差異，可以客觀地反映不同菌株的演化方向。Benedict等[18]曾通過比較泛基因組的差異研究微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)和毒力因子，本文通過比較SS2011GZ與該分離地的其他菌株以及相同血清型菌株基因組，發(fā)現(xiàn)該菌與同分離地和同血清型的豬鏈球菌共線性較差，且該菌存在大量特殊基因，系統(tǒng)發(fā)生樹處于獨立分支，證明該菌基因的獨特復(fù)雜，從側(cè)面反映動物源性致病菌進化的快速和復(fù)雜，以及接下來豬鏈球菌病的防治或?qū)⒚媾R新的危機和挑戰(zhàn)。

長期、廣泛和不恰當(dāng)?shù)厥褂毛F用抗菌藥，導(dǎo)致動物源細菌的耐藥問題較為普遍和嚴重。資料表明，國內(nèi)外豬鏈球菌對四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均已高度耐藥，分別高達70%與90%[19-21]。本課題組從暴發(fā)豬鏈球菌病的仔豬氣管中分離并鑒定豬鏈球菌SS2011GZ，基因組中發(fā)現(xiàn)多個不同類型的抗生素耐藥基因，包括四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、林可酰胺類、甲砜霉素類抗生素的耐藥基因。我國臨床分離的豬鏈球菌株一般對四環(huán)素和紅霉素耐藥，但多對青霉素類敏感[22]。值得注意的是，頭孢噻呋作為豬鏈球菌病治療的敏感藥物[23]，在臨床上被廣泛運用，而該菌基因組中存在數(shù)個頭孢菌素的抗性基因，需引起養(yǎng)豬業(yè)對于濫用抗生素的反思和重視。

綜上，本研究從廣東某豬場罹患肺炎仔豬氣管中分離到1株豬鏈球菌1型，命名為SS2011GZ。斑馬魚攻毒試驗提示該菌毒力較強，可能與其具備多個毒力因子有關(guān)。與當(dāng)?shù)胤蛛x株和同血清型株的共線性分析、進化樹分析、核心基因分析揭示，該菌的基因組復(fù)雜、獨特，這對于豬鏈球菌病的防控有一定參考意義。