張楨，朱曉峰，崔雷鴻，虞德夫，杭蘇琴

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心/江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室/消化道微生物研究室，江蘇 南京 210095)

近年來，抗生素濫用導(dǎo)致細菌耐藥性問題日益嚴(yán)峻，隨著我國頒布的禁抗令開始執(zhí)行，尋找可靠、安全無副作用的抗生素替代品成為養(yǎng)殖行業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。益生菌通過定植在宿主胃腸道內(nèi)，改變宿主腸道內(nèi)菌群組成，并通過調(diào)節(jié)宿主黏膜與系統(tǒng)免疫功能，促進宿主對營養(yǎng)成分的吸收，維持動物機體健康[1]。李宗凱等[2]研究表明，益生菌可顯著提高育肥豬生長期平均日增重，降低料重比。梅文晴等[3]研究表明，早期飼喂復(fù)合益生菌對肉仔雞盲腸內(nèi)容物中細菌多樣性無顯著影響，但可升高某些有益菌的定植豐度；上調(diào)小腸上皮組織中緊密連接相關(guān)基因的表達，促進絨毛的生長，從而潛在地影響肉雞早期和后期的生長性能。益生菌已成為養(yǎng)殖業(yè)中廣受關(guān)注的一類飼料添加劑。

乳酸菌是一類通過利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌統(tǒng)稱。乳酸菌大量定植可使腸道pH值下降，造成偏酸的腸道環(huán)境，導(dǎo)致致病菌難以生存，從而實現(xiàn)保護腸道微生物穩(wěn)態(tài)和增強機體免疫功能的效果[4]。然而一些研究結(jié)果表明，乳酸菌也能夠從敗血癥[5]和肝膿腫[6]患者體內(nèi)分離出，這增加了人們對益生菌安全性問題的關(guān)注。因此，在益生菌用于生產(chǎn)前其安全性必須得到重視和檢測。益生菌從食入到定植需要一定時間，且只有在胃以及腸道內(nèi)具有較高的存活率才能發(fā)揮作用，因此對益生菌進行模擬胃腸道消化試驗，檢測其對模擬胃腸道的耐受性。

本試驗對分離自某豬場不同生理階段豬結(jié)腸、盲腸黏膜、食糜處的3株乳酸桿菌，通過溶血性試驗及有害代謝產(chǎn)物檢測其安全性，通過抗生素敏感試驗對其抗逆性以及對模擬腸道耐受能力進行探討，為其在生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

3株乳酸桿菌羅伊乳桿菌(L.reuteri)L45(簡稱L45)，植物乳桿菌(L.plantarum)L47(簡稱L47)和約氏乳桿菌(L.johnsonii)(簡稱L63)由本實驗室自行分離自江蘇某豬場不同生理階段(仔豬、生長肥育豬、母豬)腸黏膜和食糜[7]。菌株用MRS培養(yǎng)基(青島海博生物有限公司)于37 ℃活化培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心10 min，重懸于無菌生理鹽水中備用?；撴溓蚓?Streptococcuspyogenes)ATCC 19615購自美國菌種保藏中心。

1.2 生長特性檢測

通過對活化的乳酸桿菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h的生長曲線、活菌數(shù)、pH值和乳酸產(chǎn)量進行測定，對凍存于-20 ℃的3株豬源乳酸桿菌以及按照3株乳酸桿菌1∶1∶1比例復(fù)配菌株(簡稱MIX)的存活情況、生長特性進行檢測。將活化的乳酸桿菌按1% 的接種量接種于MRS 培養(yǎng)基，接種后每2 h進行取樣[8]，測定發(fā)酵液的吸光值(OD600值),以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制3株菌的生長曲線。

1.3 安全性試驗

在無菌條件下，將活化后的3株乳酸桿菌菌液分別在含5%羊血的血瓊脂平板(百思一基生物有限公司)上劃線涂布， 37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察是否有溶血圈出現(xiàn)[9]。化膿鏈球菌ATCC 19615為陽性對照菌。

在無菌條件下，將活化后的菌液按3%的接種量接入到蛋白胨水培養(yǎng)基(青島海博生物有限公司)中，37 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后滴加Kovacs靛基質(zhì)試劑2～3滴，觀察是否產(chǎn)生吲哚[10]。培養(yǎng)基顏色變?yōu)榧t色為陽性，黃色為陰性。

在無菌條件下，將活化后的3株菌株按3%的接種量分別接入Taylor氏脫羧酶試驗培養(yǎng)基(賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸，青島海博生物有限公司)，37 ℃培養(yǎng)72 h，滴加溴甲酚紫，觀察是否產(chǎn)生硝酸還原酶。培養(yǎng)基顏色由黃色變紫色為陽性，不變色為陰性。

在無菌條件下，將活化后的3株菌株按3%的接種量分別接入到硝酸鹽培養(yǎng)基(青島海博生物有限公司)中37 ℃培養(yǎng)5 d后，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液各10 滴，觀察是否產(chǎn)生氨基酸脫羧酶[11]。若變紅，則為陽性；若不變色，繼續(xù)加入少量鋅粉，如仍不變紅則也為陽性，如變紅則為陰性。

1.4 抗生素敏感性試驗

采用紙片擴散法測定菌株的抗生素敏感性試驗。取稀釋后的菌液(100 μL)均勻的涂布于90 mm的MRS瓊脂培養(yǎng)基表面，使用無菌鑷子將含抗生素(氧氟沙星、阿莫西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素和氨芐西林)的藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)放置于平板表面，37 ℃培養(yǎng)24 h后對抑菌圈直徑進行測定[12]，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[13]制定的標(biāo)準(zhǔn)，將敏感性分為耐藥、中度敏感或敏感。

1.5 模擬胃腸道耐受性試驗

人工胃液：在pH值為2.5的無菌生理鹽水中加入3.0 g/L胃蛋白酶，充分溶解后，用無菌微孔濾膜(0.22 μm)過濾除菌，得到人工胃液，37 ℃?zhèn)溆?。人工腸液：在pH值為8.0的無菌生理鹽水中，加入1.0 g/L膽鹽，充分溶解后，過濾除菌，37 ℃?zhèn)溆?。將活化的菌液?0%的接種量接入上述人工胃液中，于37 ℃培養(yǎng)4 h；接入人工腸液中培養(yǎng)20 h。采用平板涂布法對菌液進行活菌計數(shù)，按照以下公式計算存活率[14]：

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 24.0統(tǒng)計軟件中的單因素(One-way ANOVA)模型分析，Tukey S-B test比較差異顯著性，P<0.05表示差異顯著；圖表通過GraphPad prism 8.0.2軟件制作，顯著性水平為P<0.05。試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌生長特性

如圖1所示，植物乳桿菌L47在第24小時OD600值達到0.80，活菌數(shù)為8.07lg CFU/mL，顯著高于其他2株菌(P<0.05)；植物乳桿菌L47在第24小時pH值為4.01，顯著低于羅伊乳桿菌L45的4.50和約氏乳桿菌L63的4.52(P<0.05)；乳酸產(chǎn)量為135.21 mmol/L，顯著高于羅伊乳桿菌L45的108.84 mmol/L、約氏乳桿菌L63的106.12 mmol/L以及混合菌的124.49 mmol/L(P<0.05)。

A: 生長曲線；B: 培養(yǎng)24 h的活菌數(shù)；C: pH值變化；D: 培養(yǎng)24 h的乳酸產(chǎn)量注：字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)。下同圖1 試驗菌株生長特性

2.2 乳酸桿菌安全性

菌株安全性檢測結(jié)果如表1所示，3株菌的安全性檢測均表現(xiàn)陰性，即均未發(fā)生溶血現(xiàn)象，未分解色氨酸生成吲哚，未產(chǎn)生硝酸還原酶與氨基酸脫羧酶。

表1 菌株安全性試驗結(jié)果

2.3 抗生素敏感性試驗

如表2所示，3株乳酸桿菌對不同的抗菌藥表現(xiàn)出不同的耐受性。羅伊乳桿菌L45對紅霉素和鏈霉素耐藥，對阿莫西林敏感，對氧氟沙星、諾氟沙星和氨芐西林表現(xiàn)中介敏感；植物乳桿菌L47除對鏈霉素耐藥外，對其余幾種抗生素表現(xiàn)出敏感或中介敏感；約氏乳桿菌L63對所有測試抗生素耐藥。

表2 菌株的抗生素敏感性試驗結(jié)果

2.4 模擬胃腸道耐受性試驗

由圖2可以看出，3株乳酸桿菌在pH值為2.5的人工胃液分別消化4 h，其存活率均在90%以上，其中植物乳桿菌L47存活率達到了99.11%，顯著高于其他2株菌(P<0.05)。在pH值為8.0的人工腸液消化20 h后，約氏乳桿菌L63的存活率顯著高于植物乳桿菌L47(P<0.05)，達到65.53%。

圖2 菌株在人工模擬胃液(A)和腸液(B)下的存活率

3 討論

3.1 乳酸桿菌安全性

溶血是指紅細胞因水或細菌滲入而膨脹破裂，血紅蛋白逸出，進而引發(fā)動物貧血，致使動物出現(xiàn)急性器官功能障礙。本試驗結(jié)果顯示，3株乳酸桿菌均未產(chǎn)生α-溶血或β-溶血[15]，說明測試菌株均不是溶血細菌[16]。

吲哚試驗可以檢測菌株是否會將蛋白質(zhì)中的色氨酸分解產(chǎn)生吲哚，而色氨酸代謝過程發(fā)生障礙會引起肝功能衰退等多種疾病。試驗結(jié)果表明測試菌株不分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，說明不會導(dǎo)致色氨酸出現(xiàn)代謝障礙。硝酸還原酶是一種氧化還原酶，可使硝酸鹽轉(zhuǎn)換成亞硝酸鹽，導(dǎo)致組織缺氧和機體中毒；氨基酸脫羧酶是通過催化脫去某種氨基酸的羧基從而生成對應(yīng)的胺的裂解酶的總稱，由氨基酸脫羧生成的胺類多數(shù)是有毒的物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，3株乳酸桿菌代謝產(chǎn)物中均不含硝酸還原酶和氨基酸脫羧酶，因此不會轉(zhuǎn)換動物體內(nèi)或飲食中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，不會對機體產(chǎn)生有害影響，也不會裂解氨基酸形成胺類等有毒物質(zhì)使動物中毒[17]。

3.2 乳酸桿菌抗生素敏感性

抗生素通常被用于治療各種由于細菌感染或致病微生物感染而導(dǎo)致的疾病，然而由于抗生素的濫用，導(dǎo)致越來越多的細菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥性。有研究表明，耐藥細菌的耐藥基因在一定條件下可以轉(zhuǎn)移到其他細菌中，因此益生菌在使用于生產(chǎn)前需要對其耐藥性進行檢測[18]。本試驗結(jié)果表明試驗菌株都具有一定的耐藥性，約氏乳桿菌L63對試驗中使用的所有抗生素都表現(xiàn)出耐藥，植物乳桿菌L47敏感性較好，對除了鏈霉素以外的6種抗生素均表現(xiàn)出敏感或中介敏感，顯著優(yōu)于羅伊乳桿菌L45和約氏乳桿菌L63，菌株之間表現(xiàn)出了各自復(fù)雜的耐藥性。徐進等[19]對22株乳酸桿菌進行耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)，不同菌株之間的耐藥性也存在著巨大差異，因此選擇對抗生素敏感性較好的菌株用于生產(chǎn)尤為重要。由上述結(jié)果可知，試驗菌株中植物乳桿菌L47對常用的抗生素較為敏感，適合用于生產(chǎn)。但其對鏈霉素的抗性基因是否存在轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，還需進一步從基因角度驗證[20]。

3.3 乳酸桿菌模擬胃腸道耐受性

益生菌在定植之前，必須經(jīng)過胃和小腸的消化轉(zhuǎn)運，只有在經(jīng)過消化轉(zhuǎn)運之后仍具有較高存活率的益生菌才能順利定植進而發(fā)揮作用。試驗結(jié)果表明，菌株對模擬胃液的耐受性存在顯著差異，植物乳桿菌L47存活率顯著高于羅伊乳桿菌L45和約氏乳桿菌L63，有研究表明，胃液pH值會隨飲食結(jié)構(gòu)變化而在1.5～3.0之間波動，空腹時胃液pH值會低至1.5，本試驗中模擬胃液pH值為2.5，乳酸桿菌存活率有一定降低，因此這提示我們應(yīng)當(dāng)避免動物空腹食用乳酸桿菌；菌株對模擬腸液的耐受性結(jié)果表明，約氏乳桿菌L63的存活率顯著高于植物乳桿菌L47，這與模擬胃液耐受性結(jié)果相反，但是由于食用乳酸桿菌后，乳酸桿菌先經(jīng)過胃消化再經(jīng)過小腸消化，因此菌株對模擬胃液的耐受性更高更有利。綜合考慮，植物乳桿菌L47在模擬胃腸道試驗中具有更高的存活率，在真實胃腸道環(huán)境中更容易存活進而對機體產(chǎn)生有益作用[21]。

4 結(jié)論

通過對3株豬源乳酸桿菌進行生長特性、溶血性、有害代謝產(chǎn)物檢測以及模擬胃腸道耐受性試驗證實，3株乳酸桿菌均不溶血，不產(chǎn)生硝酸鹽還原酶和氨基酸脫羧酶；植物乳桿菌L47生長特性最佳，對抗生素具有較強的敏感性，不易產(chǎn)生耐藥性，在模擬腸液中存活率較高。上述特性表明，植物乳桿菌L47具有潛在優(yōu)良益生菌的特性，這為該株益生菌的開發(fā)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。