馬玉萍，薛天涵，成艷芬，朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實驗室，江蘇 南京 210095)

半纖維素是自然界中除纖維素外含量最為豐富的可再生植物多糖，木聚糖是半纖維素主要組成成分，增加對植物木聚糖的降解效率能有效提高木質(zhì)纖維素的利用效率。木聚糖由木糖分子以 β-1, 4-木糖苷鍵連結(jié)構(gòu)成主鏈。異質(zhì)多糖的木聚糖側(cè)鏈含有種類各異的糖基，如阿拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙?；萚1]。木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系，主要包括內(nèi)切β-l, 4-D-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶[2]。木聚糖酶廣泛應(yīng)用于釀酒[3]、食品、飼料[4]等行業(yè)，高效合理地利用木質(zhì)纖維素廢棄物，能夠促進(jìn)環(huán)境友好的能源轉(zhuǎn)化。

木聚糖酶的降解能力與序列來源、結(jié)合模塊特異性及其個數(shù)、催化區(qū)域的特異性有密切聯(lián)系[5]。根據(jù)木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)中序列的同源性，將其分為不同的糖苷水解酶家族，其中GH10、GH11家族被研究的最多。來源于GH10家族的木聚糖酶序列高達(dá)上千條，生物多樣性豐富，因此具有很大的探索潛能。瘤胃內(nèi)厭氧真菌對植物粗纖維具有高效的黏附和降解能力[6]，所以厭氧真菌被認(rèn)為是比細(xì)菌和酵母菌更有潛力的木聚糖酶生產(chǎn)者[7]，但目前很少有來源于厭氧真菌的木聚糖酶被開發(fā)利用。本研究從厭氧真菌基因組中挑選4個GH10家族木聚糖酶基因，在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)后測定其酶學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)利用厭氧真菌木聚糖酶資源以及研究和改造GH10家族木聚糖酶基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

在厭氧真菌基因組中挑選出4個木聚糖酶基因(A、C、D和F)和氨基酸序列，根據(jù)大腸桿菌基因編碼的偏好性，合成酶基因序列(上海生工生物有限公司)。質(zhì)粒(pET-28a)、大腸桿菌BL21(DE3)與DH5α均購自上海生工生物有限公司，卡那霉素作為抗生素使用濃度為100 μg/mL。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

DNA聚合酶與T5核酸外切酶購自 TaKaRa 公司；IPTG、卡那霉素(Kan)、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和SDS-PAGE試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DNA Marker和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自MBI公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)購自索萊寶公司；燕麥木聚糖購自Sigma公司；低黏度小麥阿拉伯木聚糖、中黏度小麥阿拉伯木聚糖、高黏度小麥阿拉伯木聚糖、不可溶小麥阿拉伯木聚糖、山毛櫸木聚糖、高黏度黑麥阿拉伯木聚糖、羅望子木葡聚糖購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；鎳珠購自HUACHUN公司；其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

LB培養(yǎng)基含：酵母粉0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g，蒸餾水定容至100 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基：100 mL LB培養(yǎng)基中加2 g瓊脂粉。

1.3 目的基因的克隆及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株

設(shè)計帶有同源臂的引物(表1)擴(kuò)增4個木聚糖酶基因序列及pET-28a載體。目的片段擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。載體循環(huán)擴(kuò)增延伸時間為1 min，其余條件不變。PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小，驗證條帶大小正確之后用膠回收試劑盒回收純化。利用T5核酸外切酶連接載體和片段并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，根據(jù)卡納抗性篩選單克隆重組子并測序。測序正確的單克隆用質(zhì)粒小提試劑盒抽取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)，將感受態(tài)涂布在含有卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。

表1 載體與4種木聚糖酶基因擴(kuò)增PCR引物

1.4 木聚糖酶的表達(dá)和純化

挑取陽性克隆的轉(zhuǎn)化子在含卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)為種子液。按照1%體積的接種量把種子液轉(zhuǎn)接進(jìn)入大體系的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)菌液OD600=0.6～0.8時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，18 ℃、220 r/min再誘導(dǎo)表達(dá)16 h。誘導(dǎo)結(jié)束后以8 000 r/min的速度離心10 min棄上清收集菌體，菌體用裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, pH=8.0, 500 mmol/L NaCl)洗1遍。將菌體重懸至OD600=10左右，加入1%體積的重懸液100 mmol/L PMSF，冰上超聲裂解細(xì)菌，超聲結(jié)束后加入0.1%體積的重懸液100 mmol/L PMSF。裂解后的菌液以10 000 r/min的速度離心30 min，收集上清與鎳珠在4 ℃下結(jié)合1～2 h后，用含10～200 mmol/L咪唑的裂解緩沖液梯度洗脫。收集各個梯度的洗脫液用SDS-PAGE檢測目的蛋白，選擇不具有雜蛋白的洗脫液用30 kDa的超濾管濃縮換液至儲存buffer(20 mmol/L Tris-HCl, pH=8.0, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT, 1 mmol/L EDTA)中。

1.5 酶活性質(zhì)的測定

木聚糖酶活力測定采用1959年Miller 等建立的DNS法。使用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。在最適反應(yīng)pH和溫度下，每分鐘降解木聚糖生成1 μmoL木糖所需的酶量定義為一個酶活力單位U，比酶活是單位重量(mg)蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)。

試驗中所有種類的木聚糖底物濃度均為0.01 g/mL。以燕麥木聚糖為底物，測定木聚糖酶最適pH值、pH穩(wěn)定性、最適溫度、溫度穩(wěn)定性及金屬離子穩(wěn)定性。最適pH值測定條件為：反應(yīng)溫度37 ℃，pH值梯度從3.0至11.0，反應(yīng)時間30 min。pH穩(wěn)定性測定條件為：選擇最適pH值及最適pH值左右兩個pH點，37 ℃孵育，隔一定時間取樣測定剩余酶活。最適溫度測定條件為：pH=7.0(0.1 mol/L Tris-HCl)，反應(yīng)溫度為18 ℃、28 ℃、37 ℃、45 ℃、53 ℃、62 ℃，反應(yīng)時間30 min。溫度穩(wěn)定性測定條件為：選擇最適溫度及最適溫度左右兩個點，即木聚糖酶A、C、F在溫度28 ℃、37 ℃、45 ℃下孵育，木聚糖酶D在溫度18 ℃、28 ℃、37 ℃下孵育，隔一定時間測定剩余酶活。金屬離子穩(wěn)定性檢測條件為：在酶促反應(yīng)體系中分別加入終濃度為5 mmol/L 的金屬離子(Ca2+、Na+、K+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Co3+)，在pH值為7、溫度為37 ℃下反應(yīng)30 min。對照組(CK)為不含任何金屬離子的酶促反應(yīng)體系。

底物特異性檢測時，分別選擇低黏度小麥阿拉伯木聚糖(WAL)、中黏度小麥阿拉伯木聚糖(WAM)、高黏度小麥阿拉伯木聚糖(WAH)、不可溶小麥阿拉伯木聚糖(WAI)、燕麥木聚糖(X)、山毛櫸木聚糖(BX)、高黏度黑麥阿拉伯木聚糖(RAX)以及羅望子木葡聚糖(ATX)為底物，在最適pH值和最適溫度下反應(yīng)30 min測定酶活。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用ProtParam tool of ExPASY(ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam/)軟件分析木聚糖酶的分子量大小、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)。采用 SPSS 20.0軟件中的One-way ANOVA 過程進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行各組間多重比較，以P<0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶序列分析與克隆表達(dá)

4種木聚糖酶基因A、C、D和F片段長度分別為1 347、1 428、1 359和1 446 bp，其理論蛋白分子量分別為49.87、54.59、50.37和54.86 kDa；理論等電點分別為8.52、4.67、9.10、4.36；理論不穩(wěn)定系數(shù)分別為26.54、32.02、24.30、38.32，都為穩(wěn)定類蛋白。

4種厭氧真菌木聚糖酶的表達(dá)見圖1，SDS-PAGE顯示，4種木聚糖酶蛋白質(zhì)分子量分別為75、70、52和73 kDa，其表達(dá)產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶性蛋白和不溶性包涵體形式存在。

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 木聚糖酶A；2. 木聚糖酶C；3. 木聚糖酶D；4. 木聚糖酶F圖1 厭氧真菌4種木聚糖酶的SDS-PAGE分析

2.2 pH對4種木聚糖酶活性的影響

4種木聚糖酶最適pH值如圖2所示，其反應(yīng)最適pH值均為8.0。木聚糖酶pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖3所示，木聚糖酶A在pH值為7.0、8.0、9.0下酶活都很穩(wěn)定，具有很高的pH耐受性；木聚糖酶C對pH值為9.0的穩(wěn)定性要優(yōu)于pH值為7.0、8.0，在長達(dá)20 h的時間內(nèi)該酶仍保留有90%的活性；木聚糖酶D在孵育初期，酶活迅速下降到60%，其pH穩(wěn)定性較差；木聚糖酶F在pH值為9.0條件下穩(wěn)定性較好，pH值為7.0和8.0條件下，孵育20 h后酶活迅速下降。

圖2 4種木聚糖酶最適pH值測定

圖3 4種木聚糖酶的pH穩(wěn)定性

2.3 溫度對4種木聚糖酶活性的影響

木聚糖酶D最適反應(yīng)溫度為37 ℃，其余3種木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃(圖4)。木聚糖酶溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖5所示，木聚糖酶A在孵育溫度為37 ℃時隨著時間延長酶活有所提高；木聚糖酶C在37 ℃時有很好的穩(wěn)定性，24 h之內(nèi)酶活基本無變化，而隨著孵育溫度升高酶活的穩(wěn)定性變差；木聚糖酶D在孵育溫度為28 ℃下酶活衰減較慢，而在37 ℃、45 ℃下孵育1 h后酶活衰減到原有酶活的75%，在酶活下降到75%之后保持基本不變； 木聚糖酶F在最適溫度45 ℃下穩(wěn)定性最好。

圖4 4種木聚糖酶的最適溫度

圖5 溫度對4種木聚糖酶活性的影響

2.4 金屬離子對4種木聚糖酶活性的影響

金屬離子對4種木聚糖酶活性的影響見圖6。對木聚糖酶A的酶活具有明顯促進(jìn)作用的金屬離子有Ca2+、Mn2+、Mg2+(圖6)，具有明顯抑制作用的金屬離子有Zn2+、Cu2+、Co3+；對木聚糖酶C的酶活具有明顯促進(jìn)作用的金屬離子有Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+，具有明顯抑制作用的金屬離子有Zn2+、Cu2+；對木聚糖酶D的酶活具有明顯促進(jìn)作用的金屬離子有Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+，具有明顯抑制作用的金屬離子有Zn2+、Cu2+、Co3+；對木聚糖酶F的酶活具有明顯促進(jìn)作用的金屬離子有Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co3+，具有明顯抑制作用的金屬離子有Zn2+。Ca2+對4種木聚糖酶的酶活促進(jìn)作用最強(qiáng)，最高達(dá)到4倍促進(jìn)作用。

注：字母相同表示差異不顯著(P>0.05),不同表示差異顯著(P<0.05)。下同圖6 金屬離子對4種木聚糖酶活性的影響

2.5 底物對4種木聚糖酶活性的影響

底物對4種木聚糖酶活性的影響見圖7。4種木聚糖酶對山毛櫸木聚糖的親和力顯著高于其他底物(P<0.05)。木聚糖酶A、C對4種不同的小麥阿拉伯木聚糖的降解效率沒有顯著差異(P<0.05)，木聚糖酶D、F對羅望子木葡聚糖的降解效率顯著低于其他底物(P<0.05)。

圖7 底物對4種木聚糖酶的影響

3 討論

木聚糖位于木質(zhì)素和纖維素的中間交界處，在連接兩者的同時，木聚糖對維持植物細(xì)胞纖維的凝聚力和細(xì)胞壁的完整性起著重要作用[8]，是降解木質(zhì)纖維素的重要阻礙之一，生物酶解是提高廢棄農(nóng)作物利用率的主要手段之一。目前關(guān)于木聚糖酶的研究主要包括篩選高產(chǎn)木聚糖酶菌株、構(gòu)建多效復(fù)合酶、優(yōu)化培養(yǎng)及工藝條件、定向改造酶學(xué)性質(zhì)等。但如何獲得低成本、高催化效率的木聚糖酶仍然是實際工業(yè)生產(chǎn)的主要瓶頸問題。瘤胃中存在許多能夠高效降解木質(zhì)纖維素的厭氧真菌，相較于其他途徑制得的木聚糖酶活性會更高[9]，因而其更具有開發(fā)潛能。

本研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶A、C和F都具有良好的pH值和溫度穩(wěn)定性，這一特性在酶工藝生產(chǎn)中占據(jù)很大的優(yōu)勢，還可以通過分析基因序列對定向改造酶的穩(wěn)定性提供參考。Ca2+能提高4種木聚糖酶的酶活并且效果顯著，可能是由于Ca2+作為輔因子增加了金屬離子結(jié)合位點的親和力使蛋白更加穩(wěn)定, Pantoliano等[10]以枯草桿菌絲氨酸蛋白酶為模型發(fā)現(xiàn)一定濃度的Ca2+能有效提高酶的動力學(xué)穩(wěn)定性。曾霖霖等[11]發(fā)現(xiàn)Ca2+對菠蘿蛋白酶的酶活和熱穩(wěn)定性都具有促進(jìn)作用。本研究中的4種木聚糖酶對除山毛櫸木聚糖外其他底物降解效率低，可能是由于這4種木聚糖酶作用的糖苷鍵單一或者沒有經(jīng)過更完整的表觀遺傳修飾導(dǎo)致功能不全[12]。由于4種木聚糖酶都來自于糖苷水解酶第10家族，而該家族的酶主要包含內(nèi)切木聚糖酶、內(nèi)轉(zhuǎn)換糖基化酶、內(nèi)切β-1, 4葡聚糖酶。山毛櫸來源的木聚糖中木糖成分占比高達(dá)82%，而在小麥阿拉伯木聚糖(低、中、高黏度)和黑麥阿拉伯木聚糖中木糖占比60%左右，阿拉伯糖占比38%左右。由于木聚糖酶無法有效作用于阿拉伯糖基進(jìn)而無法高效降解小麥阿拉伯木聚糖，所以這4種木聚糖酶對小麥阿拉伯木聚糖的降解能力低于山毛櫸木聚糖。底物結(jié)構(gòu)中木糖所占比例、側(cè)鏈糖基類型決定了4種木聚糖酶對底物的降解能力。

目前纖維素酶基因、花生條紋外殼病毒蛋白基因都是用大腸桿菌表達(dá)，因為大腸桿菌基因背景和表達(dá)調(diào)控過程清楚，培養(yǎng)周期短。本研究中，大腸桿菌表達(dá)的厭氧真菌來源的木聚糖酶比酶活相對較低，可能是因為4種木聚糖酶為真核蛋白，在大腸桿菌的原核表達(dá)過程中，沒有經(jīng)過完整修飾導(dǎo)致酶活下降。Wu等[13]把來源于人纖溶酶原的Kringle - 1結(jié)構(gòu)域與鏈激酶的C-末端融合，分別進(jìn)行真核表達(dá)和原核表達(dá)，結(jié)果表明原核表達(dá)的融合蛋白沒有生物活性，而畢赤酵母表達(dá)的融合蛋白由于N-端發(fā)生糖基化而具有生物功能。戴建華等[14]發(fā)現(xiàn)雞γ-干擾素基因在原核表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在并無抗病毒活性，而在真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物抗病毒效價卻很高。

4 結(jié)論

本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了4種來自瘤胃厭氧真菌的木聚糖酶基因，這4種酶具有良好的pH值和溫度穩(wěn)定性，對山毛櫸木聚糖的親和力最高，Ca2+具有明顯的酶活促進(jìn)作用。本研究獲得的4種木聚糖酶具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值，為探索瘤胃中粗纖維降解資源提供參考。