鄭通文，蔡民政，劉 璐，孫正祥，周 燚

（長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/湖北省農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心，湖北荊州 434025）

【研究意義】由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON）侵染引起的西瓜枯萎病是一種世界性土傳病害，于1894年Smith首次報(bào)道，現(xiàn)已分布于世界各地的西瓜種植區(qū)[1?3]。該病害的病原孢子在土壤中可存活10年之久[4]，且寄主廣泛，給病害的控制帶來嚴(yán)重困難。目前防治西瓜枯萎病的方法主要有農(nóng)業(yè)防治、抗病育種和化學(xué)防治[5]。農(nóng)業(yè)防治簡(jiǎn)單有效但費(fèi)時(shí)費(fèi)力；選育抗病品種周期長(zhǎng)、難度大；化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，且造成環(huán)境污染。利用植物有益生防菌進(jìn)行生物防治既環(huán)保經(jīng)濟(jì)又可持續(xù)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】目前報(bào)道的西瓜枯萎病生防菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）和假單胞桿菌屬（Pseudomonasspp.）[6]，如：解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefa?ciens）[7?8]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）[9]。【本研究切入點(diǎn)】這些菌株具有良好的室內(nèi)防效，但其田間防效穩(wěn)定性不理想，難以推廣應(yīng)用[10]。因此，篩選更多更優(yōu)質(zhì)的生防資源具有重要的意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究從健康的油菜植株及根際分離篩選對(duì)西瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌，測(cè)定其抑菌譜、盆栽防效和對(duì)西瓜植株的促生作用，以期為西瓜枯萎病的生物防治提供更多的菌源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試病原菌：西瓜枯萎病菌（FON）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄早疫病菌（Alternaria so?lani）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、白芨白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）和玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）均由本實(shí)驗(yàn)室分離與保存，棉花黃萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所惠贈(zèng)。

西瓜品種：西農(nóng)8號(hào)，由原西北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研人員選育。培育西瓜所用的基質(zhì)土為長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院自行研發(fā)的育苗專用基質(zhì)土。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）及相應(yīng)的固體培養(yǎng)基[11]。

1.2 西瓜枯萎病拮抗菌株的分離純化

以五點(diǎn)取樣法，2019年從荊州12塊油菜田采集長(zhǎng)勢(shì)良好的油菜植株，抖去根部大量土壤，用滅菌的毛刷輕輕刷下根際土（約0.5 mm厚度），將油菜植株和根際土分別裝在采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。根際細(xì)菌的分離：取10 g根際土，加入90 mL無菌水懸浮，獲得10?1稀釋液，依次梯度稀釋，取適量的10?7，10?8，10?9稀釋液涂布于NA平板[12]。油菜內(nèi)生菌分離：稱量1 g的油菜根組織，表面消毒后，充分研磨，梯度稀釋，取適量的10?4，10?5，10?6稀釋液涂布于NA平板。將上述的NA平板置于28°C培養(yǎng)箱中，48 h后挑取顏色、光澤、邊緣光滑度和厚度不同的單菌落于新的NA平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，所得菌株斜面保存，備用。

1.3 西瓜枯萎病拮抗菌株的初篩

采用平板對(duì)峙法[13]，將病原菌（FON）菌餅接種至PDA平板中央，在平板兩側(cè)距平板中央各2.5 cm的地方平行劃線接種待測(cè)細(xì)菌，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理3次重復(fù)，4 d后測(cè)量各處理的抑菌帶大小。

1.4 西瓜枯萎病拮抗菌株的復(fù)篩

將初篩的菌株分別接種于NB中，于28°C、130 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。在PDA平板中央接種培養(yǎng)72 h的西瓜枯萎病菌菌餅（直徑6 mm），用無菌的打孔器在距離中央2 cm處三點(diǎn)對(duì)稱打孔，每孔中分別注入100μL待測(cè)菌株的菌液，以接種等體積的NB為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照平板中西瓜枯萎病菌菌絲即將長(zhǎng)滿全皿時(shí)，測(cè)量各處理組的抑菌帶大小。

1.5 菌株YZU-S8抑菌譜的測(cè)定

參照J(rèn)eong等[14]并稍作改進(jìn)，制備YZU?S8的無菌濾液，將無菌濾液混入冷卻至55 ℃左右的PDA中，使其終濃度分別為5%、10%和20%，倒成平板。以混入相同體積的NB為對(duì)照。在PDA平板中央接入待測(cè)病原菌菌餅，28 ℃倒置培養(yǎng)。每處理4次重復(fù)。待對(duì)照組菌絲幾乎長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)量各組的菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率[15]。

1.6 YZU-S8對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效測(cè)定

挑取健康、飽滿的西瓜種子，進(jìn)行常規(guī)的播種處理[16]。待西瓜幼苗長(zhǎng)出第3片真葉后，將其移栽至塑料盆中[17]。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)處理：（1）病原菌（FON）+提前3 d接種YZU?S8；（2）病原菌（FON）+同時(shí)接種YZU?S8；（3）病原菌（FON）+NB。

將FON接種到PDB中，28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，所得菌液用無菌紗布過濾后得到分生孢子懸浮液，將其混入無菌基質(zhì)土中制成病土（105個(gè)孢子/克）。制備YZU?S8懸浮液（108cfu/mL），接種時(shí)對(duì)西瓜幼苗進(jìn)行灌根，每株接種30 mL。以接種等體積的NB為對(duì)照，每個(gè)處理15株西瓜苗，3次重復(fù)。西瓜植株均放置于（25±2）℃溫室中培養(yǎng)，光照∶黑暗=12 h∶12 h。接種病原菌（FON）后21 d，參照王夏雯等[18]方法，調(diào)查西瓜植株的發(fā)病嚴(yán)重度和計(jì)算相應(yīng)的病情指數(shù)、防效。

1.7 YZU-S8對(duì)西瓜植株的促生長(zhǎng)測(cè)定

西瓜的種植、生防菌液的制備和接種同1.6。以接種等體積的NB為對(duì)照，每處理12株西瓜植株，3次重復(fù)。將西瓜植株放在（25±2）℃溫室中培養(yǎng)，光照∶黑暗=12 h∶12 h，30 d后測(cè)量并記錄西瓜植株的主蔓長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和葉綠體含量等指標(biāo)。

1.8 YZU-S8的分子鑒定

使用OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取YZU?S8的總DNA，采用16S rDNA基因通用引物（27F：5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′和1492R：5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′）[19]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PCR StarMix 20 μL、正引物1.0 μL、反引物1.0 μL、DNA 2.0 μL和ddH2O 16 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 °C變性40 s、58 °C退火40 s、72 °C延伸60 s，變性、退火和延伸循環(huán)30次后于72 ℃繼續(xù)延伸10 min。取少量PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余產(chǎn)物送至擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所得序列在NCBI的GenBank中進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行Duncan’s多重比較，檢驗(yàn)組間差異顯著性，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜枯萎病拮抗菌株的分離和初篩

從油菜根及根際土樣品中共分離得到內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌127株，經(jīng)平板對(duì)峙初篩出17株對(duì)西瓜枯萎病菌有拮抗作用的細(xì)菌，其中70%為根際細(xì)菌（表1）。

表1 西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的分離和初篩Tab.1 Isolation and screening of biocontrol bacteria against watermelon Fusarium wilt

2.2 西瓜枯萎病拮抗菌株的復(fù)篩

拮抗菌株的復(fù)篩結(jié)果表明，抑菌帶寬超過5 mm的菌株共有7株，其中內(nèi)生細(xì)菌YZU?S8對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制活性最強(qiáng)，形成的抑菌帶寬達(dá)10 mm以上（表2），作為后續(xù)研究的菌株。

表2 西瓜枯萎病生防細(xì)菌的復(fù)篩Tab.2 Secondary screening of biocontrol bacteria against watermelon Fusarium wilt

2.3 菌株YZU-S8的抑菌譜測(cè)定

抑菌譜測(cè)定結(jié)果表明，YZU?S8的無菌濾液在不同濃度下對(duì)9種供試的病原菌均有抑制作用（表3），濃度為20%時(shí)其抑制率為40.35%～98.95%，其中對(duì)白芨白絹病菌的抑制率最高（98.95%）。

表3 菌株YZU-S8的抑菌譜測(cè)定Tab.3 Antifungal spectrum of YZU-S8

2.4 YZU-S8對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效結(jié)果表明，只接種西瓜枯萎病菌的植株病情指數(shù)為81.33，而提前3 d和同時(shí)接種YZU?S8菌株的植株病情指數(shù)分別為21.33和40.00，相對(duì)防效分別為73.8%和50.8%（表4）。

表4 菌株YZU-S8對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效Tab.4 Control effect of YZU-S8 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment

2.5 YZU-S8對(duì)西瓜植株的促生作用

促生試驗(yàn)結(jié)果表明，接種生防菌YZU?S8后30 d，西瓜植株長(zhǎng)勢(shì)與對(duì)照相比存在顯著差異，其主蔓長(zhǎng)和根長(zhǎng)的增加量分別為8.01 cm和8.34 cm，地上鮮質(zhì)量增加了6.88 g（表5）。

表5 YZU-S8對(duì)西瓜植株的促生作用Tab.5 Effect of YZU-S8 on the growth of watermelon plants

2.6 YZU-S8的分子鑒定

YZU?S8菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 381 bp，BLAST結(jié)果表明其與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）S1?5?7的16S rDNA序列具有100%的相似度。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示菌株YZU?S8與貝萊斯芽孢桿菌在同一分支上（圖1），初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖1 基于YZU?S8的16S rDNA序列及其相似序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA of YZU?S8 and its homologous sequences

3 討論與結(jié)論

植物根際細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌通常在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)病害的防御過程中起著重要的作用，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中與植物之間建立了友好的共生關(guān)系，是植物病害生防菌劑的重要來源，具有巨大的開發(fā)價(jià)值[20?21]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多關(guān)于植物根際細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害的報(bào)道[22?24]。為了拓寬西瓜枯萎病生防菌株的來源，獲得更高效的拮抗菌，本研究從油菜根和根際分離篩選出一株對(duì)西瓜枯萎病菌具有顯著抑制活性的內(nèi)生菌株YZU?S8，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。YZU?S8的無菌濾液對(duì)病原真菌表現(xiàn)出了廣譜的抑制作用，表明其可產(chǎn)生具有抑菌效果的活性代謝產(chǎn)物。然而，該菌株能合成的抑菌物質(zhì)的成分尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

防病和促生是生防菌株應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐所必備的兩大功能，也是篩選拮抗菌株的主要指標(biāo)[25]。趙佳等[26]篩選得到的解淀粉芽孢桿菌Lh?1對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效為78.5%，且對(duì)西瓜植株具有顯著的促生作用。在本研究中，菌株YZU?S8在盆栽實(shí)驗(yàn)中對(duì)西瓜枯萎病也表現(xiàn)出了良好的防效，且該菌株對(duì)西瓜植株具有顯著的促生作用，使其蔓長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量有了明顯的增加，這有助于增強(qiáng)西瓜的抗病能力，進(jìn)而降低西瓜枯萎病的發(fā)病率。因此，菌株YZU?S8在防治西瓜枯萎病方面具有良好的開發(fā)潛力。

生防菌的田間防效易受土壤條件、作物生長(zhǎng)狀況及根際生態(tài)系統(tǒng)等多種因素的影響，導(dǎo)致防效不穩(wěn)定，嚴(yán)重阻礙了生防芽孢桿菌的推廣應(yīng)用[27]。此外，生防芽孢桿菌與病原微生物的競(jìng)爭(zhēng)作用是其防治植物病害的重要作用機(jī)制之一[28]。因此，需要進(jìn)一步研究菌株YZU?S8對(duì)西瓜枯萎病的田間防效和在西瓜植株上的定殖能力，為其研發(fā)應(yīng)用提供更多的實(shí)踐基礎(chǔ)。