張 琦，申 帥，胡先奇*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南昆明 650201）

【研究意義】植物根結(jié)線蟲是世界范圍內(nèi)主要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要寄生于植物的根部組織，據(jù)統(tǒng)計，全球每年因植物根結(jié)線蟲造成的直接經(jīng)濟損失就高達1 570億美元[1]，世界農(nóng)業(yè)平均減產(chǎn)24.5%[2]。植物根結(jié)線蟲不僅能通過分泌物感染寄主，而且還能為其他病原微生物的感染打開通道，引起繼發(fā)病害。化學防治一直作為根結(jié)線蟲防治的主要手段，但其帶來的對環(huán)境的嚴重破壞，其殘留物對人畜的毒害等副作用也日益凸顯。而抗病品種的應用目前并不廣泛；作物輪作的方法對發(fā)展中國家和人口眾多的國家來講，糧食需求量巨大，務農(nóng)者經(jīng)濟收入降低等因素并未廣泛應用[3]。所以近年來，生物防治手段因低毒、高效、人畜無害、環(huán)境友好的優(yōu)點，其探索日益發(fā)展迅速。【前人研究進展】微生物是植物根結(jié)線蟲生物防治劑豐富的天然來源，放線菌在防治植物寄生線蟲中起重要作用，Rashad等[4]從20份土壤樣品中分離出了29株具有殺線活性的鏈霉菌。陳井升等[5]從大豆根際土壤中分離出了具有殺線活性的鏈霉菌S.par?vusH?2。Kaur等[6]報道了一種來自氫鏈霉菌菌株DH16的新型抗真菌化合物，該菌株發(fā)酵液上清液具有較強的殺線蟲活性。金娜等[7]發(fā)現(xiàn)紅灰鏈霉菌HDZ?9?47在田間施用時可有效地防治南方根結(jié)線蟲病。Manish等[8]報道了具有殺線蟲活性鏈霉菌菌株M7。Ruanpanun等[9]報道了鏈霉菌屬CMU?M021產(chǎn)生兩種抗真菌化合物，其中化合物Fervenuline對二齡幼蟲具有較高的致死率。胡夢君[10]報道了放線菌菌株1331發(fā)酵液可有效地抑殺南方根結(jié)線蟲，并在溫室盆栽試驗中取得了較好的防治效果。焉小寧等[11]分離得到對南方根結(jié)線蟲具有較高生物活性的玫瑰暗黃鏈霉菌。周銀麗等[12]報道了淡紫灰鏈霉菌MZ11不但對石榴枯萎病菌具有較好的室內(nèi)拮抗作用，其50%濃度的發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲卵孵化也具有較好的抑制效果。

【本研究切入點】到目前為止，已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)很多對根結(jié)線蟲具有較好抑制活性的放線菌，但是大部分生防菌的研究仍停滯在實驗室研究階段，只有為數(shù)不多的生物防治劑被商業(yè)化并在該領域大規(guī)模應用[13]。生物防治劑能否成功應用的關鍵制約因素是它們在各種環(huán)境條件下的作用性能能否保持穩(wěn)定[14]?！緮M解決的關鍵問題】本試驗以云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場、昆明撈魚河濕地公園以及云南省陸良縣土樣中分離出的101株放線菌為篩選對象，通過其發(fā)酵液上清液及土壤穩(wěn)定性試驗篩選用于防治南方根結(jié)線蟲病的生防菌，以期為南方根結(jié)線蟲病的防治拓寬新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 采自云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場、昆明撈魚河濕地公園、云南省陸良縣土壤樣本。選取每塊田地的四角位置和中間位置為采集點。采集時，在植株周圍選3處不同位置用鐵鏟挖至10～15 cm處，每個位置取100 g左右的土壤去除肉眼可見較大明顯的石塊或者腐質(zhì)，然后裝至無菌自封袋中，混合均勻，帶回實驗室后去雜和過篩處理[12]。

1.1.2 培養(yǎng)基 放線菌分離培養(yǎng)基：放線菌的分離采用高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基。放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：高氏合成1號液體培養(yǎng)基。

1.1.3 供試線蟲 南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）：來自云南農(nóng)業(yè)大學線蟲實驗室。

1.1.4 供試植株和藥劑 空心菜：云南農(nóng)業(yè)大學線蟲實驗室保存。1%阿維菌素顆粒：山東省綠士農(nóng)藥有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌的分離和純化 放線菌的分離采用稀釋涂布平板法[15]。放線菌的純化：在培養(yǎng)的第7天挑取單菌落至高氏1號固體培養(yǎng)基上劃線純化，將純化后的培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，挑取單菌落，再度在高氏1號固體培養(yǎng)基上劃線純化。然后挑取純化好的單菌落接種于高氏合成1號固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)并編號。

分離、純化共獲得放線菌101株。分別來自云南農(nóng)業(yè)大學試驗田編號為YN1～YN30，昆明撈魚河濕地公園編號為LY1～LY47，云南省陸良縣編號為LP1～LP22、JG1～JG4、GT6。

1.2.2 二齡幼蟲蟲懸液的制備 將收集挑取的卵塊放在消毒過的中性濾紙上，置于消毒過的網(wǎng)篩上，再將網(wǎng)篩放置在盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，使水剛好浸濕濾紙，然后一起放到28 ℃培養(yǎng)箱中孵化，每12 h收集一次線蟲于敞口的燒杯中（燒杯中淺水即可）。放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ㄇ形鹚桑?/p>

1.2.3 根結(jié)線蟲生防菌的初步篩選 （1）放線菌發(fā)酵液的制備：因所要發(fā)酵的菌種較多所以選用50 mL的離心管作為發(fā)酵容器，每管裝30 mL經(jīng)滅菌過的高氏合成1號液體培養(yǎng)基[16]。然后用接種針挑取純化后的菌絲于液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)96 h。（2）發(fā)酵液對二齡幼蟲的影響：將發(fā)酵液在8 000 r/min離心5 min，取上清液3 mL到直徑6 cm的小培養(yǎng)皿中。再將無菌水沖洗過的線蟲加入培養(yǎng)皿中，定容線蟲濃度為30條/mL（每皿100條左右），以無菌水作為對照組，3次重復。放入28 ℃恒溫箱中24 h之后鏡檢各處理線蟲的死亡率并計算校正死亡率。僵直不動，用牙簽或挑針戳動仍然僵直無活性的判為死亡。計算線蟲死亡率和校正死亡率公式為[17]：

1.2.4 根結(jié)線蟲生防菌的進一步篩選 經(jīng)初篩后，選取具有高效殺線活性的放線菌發(fā)酵液進行進一步復篩，按1.2.3步驟發(fā)酵液離心后，取上清液稀釋1.25倍、2倍和5倍，分別測試對二齡幼蟲的擊倒率，以清水為對照組，3次重復，24，48，72 h后鏡檢記錄。

1.2.5 土壤穩(wěn)定性試驗 取顆粒飽滿的空心菜種子，先用2%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min。然后，用無菌水多次沖洗干凈，再放置清水中浸泡過夜，第二天將種子放在濕潤的中性濾紙上，置于培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)催芽。

邊長7 cm、高度8 cm的小盆中分別裝入滅菌土，滅菌土比例按m（紅土）∶m（腐殖土）=3∶1配置。將發(fā)芽的種子移栽自盆中，每盆一株，溫室培養(yǎng)10 d后，每盆用30 mL的發(fā)酵液原液灌根，灌根后，即接入線蟲，每株400頭左右。以1%阿維菌素為標準對照組，清水為空白對照組。1%阿維菌素對照組采用顆粒劑與滅菌土混勻回填的方式施藥[10]，施藥劑量約為500 mg/kg。每組5次重復，30 d后隨機處理3個重復，觀察統(tǒng)計根結(jié)數(shù)量，統(tǒng)計根結(jié)百分比率，分析病害級別，計算病情指數(shù)和防治效果。

根結(jié)百分比率（%）：根系中的根結(jié)占整個根系的比例（目測，估計）。

根結(jié)線蟲分級標準參照Hartman[18]的方法。0級：根系完整，無根結(jié)；1級：僅有少量根結(jié)，根結(jié)百分比率小于1/4；3級：根結(jié)百分比率為1/4～1/3；5級：根結(jié)形成中等數(shù)量，根結(jié)百分比率為1/3～1/2；7級；根結(jié)數(shù)量較多，根結(jié)百分比率大于1/2；9級：根部長滿根結(jié)。

1.2.6 生防菌LY4的鑒定 培養(yǎng)特征：將放線菌菌株LY4分別接種到高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽淀粉培養(yǎng)基、甘油?天門冬酰胺培養(yǎng)基、酵母膏?麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基、酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、葡萄糖硝酸鹽培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～15 d。借鑒參考文獻[19?20]的方法，觀察菌株氣絲、基內(nèi)菌絲在各種培養(yǎng)基上的形態(tài)特征、顏色，有無可溶性色素及生長等情況。

生理生化鑒定借鑒參考文獻[20]的方法。（1）明膠液化。將菌種穿刺接種到明膠液化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7～15 d觀察其液化情況。觀察前先將菌種管放置4 ℃冰箱中冷藏20～30 min。若明膠仍是固體，則不液化；若有液體，則明膠液化。（2）酪氨酸水解。將菌種接種到酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～15 d，觀察是否有黑色素產(chǎn)生。若有黑色素產(chǎn)生，說明菌株具有酪氨酸酶。（3）硫化氫生成。將菌種穿刺接種到硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～15 d觀察是否有黑褐色色素產(chǎn)生。若有，則有H2S產(chǎn)生，H2S與檸檬酸鐵生成黑色硫化鐵。（4）纖維素上生長。將菌種接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長情況。若菌株正常生長則能利用纖維素，若無法生長，則不能利用纖維素。（5）碳源利用。不同放線菌利用不同碳源的能力差異很大。將菌株接種到不同碳源的培養(yǎng)基上觀察其生長狀況。若菌落生長表明可利用該碳源，反之則不能利用該碳源。

1.2.7 菌株LY4的分子鑒定 DNA的提取，借鑒飽和酚法[21]。16S rDNA的PCR的擴增：采用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增。

PCR反應體系：2×PowerTaqPCR MasterMIX 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 8.5μL，總體積25μL。

測序及分析：將呈陽性的菌液送至生工生物工程股份有限公司進行測序，所得序列用BLAST在Gen-Bank中進行同源性對比，再用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲生防菌的初步篩選

從云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場、昆明撈魚河濕地公園采集和云南省陸良縣采集的土壤樣本中，分離到101株菌落特征各不相同的放線菌，通過發(fā)酵液原液上清液的初步篩選獲得3株防效高于90%的放線菌菌株LY4、LY8和GT6。

2.2 根結(jié)線蟲生防菌的進一步篩選

24，48，72 h后，3株放線菌的發(fā)酵上清液在3種不同濃度的稀釋倍數(shù)下對南方根結(jié)線蟲都有抑殺作用。3株放線菌發(fā)酵上清液在1.25倍稀釋倍數(shù)下，處理南方根結(jié)線蟲48 h后的的校正死亡率都能達到100%；在5倍的稀釋條件下，處理南方根結(jié)線蟲72 h后的校正死亡率都能達到70%以上，其中菌株GT6效果最好，達92.60%，與菌株LY4、LY8差異顯著（表1）。

30 d后各植株的防治效果如表2，可以看出，防效最好的是LY4，而在離體生測試驗中效果最好的GT6在盆栽試驗中防治效果反而并不突出。

2.3 生防菌LY4的鑒定

2.3.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征 在高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基上氣生菌絲為白色、較薄，菌落表面干燥、絨狀，凸起?；z粉紅色略顯淡紫色，有紫色可溶性色素。孢子絲直，孢子橢圓形，表面光滑（圖1）。放線菌LY4在各種鑒定培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征（表3）。

2.3.2 生理生化特征 放線菌菌株LY4能利用蔗糖、D?棉子糖、D?半乳糖、肌醇、D?甘露糖，不能利用D?木糖、D?果糖、L?鼠李糖、D?阿拉伯糖。明膠液化，不產(chǎn)類黑色素和H2S，不能利用纖維素（表4）。

2.3.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 用提取的DNA為模板，細菌通用引物27F、1492R為引物進行PCR擴增，放線菌LY4的16S rDNA擴增產(chǎn)物大小1 500 bp左右（圖2）。

表1 3株放線菌的發(fā)酵上清液在3種不同濃度的稀釋倍數(shù)下對南方根結(jié)線蟲抑殺作用Tab.1 Antifungal effect of fermentation supernatants of three actinomycetes on southern root-knot nematodes at three different concentrations

表2 土壤穩(wěn)定試驗（30 d）Tab.2 Soil stability test

圖1 菌株LY4的顯微照片（400×）Fig.1 The microscopy morphology of the strain LY4（400×）

表3 放線菌LY4在各種鑒定培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Tab.3 Culture characteristics of actinomycetes strains LY4 in different media

表4 菌株LY4的生理生化特征Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of strain LY4

PCR產(chǎn)物的回收與純化及分子克隆測序獲得的菌株LY4的16S rDNA序列1 469 bp，與GenBank中相關序列進行Blast相似性對比，放線菌菌株LY4與淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）的16S rDNA序列同源性為99.05%，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）與淡紫灰鏈霉菌（D85114.1）處于同一分支。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征以及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，初步將放線菌菌株LY4鑒定為淡紫灰鏈霉菌。

3 結(jié)論與討論

本研究以土壤中分離、篩選出的101株放線菌菌株為對象，經(jīng)初步篩選得到3株對南方根結(jié)線蟲致死率高于90%的放線菌菌株：LY4、LY8和GT6。LY4、LY8和GT6發(fā)酵液原液稀釋2倍和5倍的條件下處理南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲72 h的校正死亡率分別為99.64%、98.67%、100.00%和78.85%、73.16%、92.60%，在土壤穩(wěn)定性試驗中，3組防效差異顯著，LY4相較于LY8組和GT6組，防效最好，防效為71.10%。結(jié)合菌株LY4在鑒定培養(yǎng)基上的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征、生理生化鑒定和16S rDNA的多項指標分析，初步將放線菌菌株LY4鑒定為淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）。

目前，關于放線菌對根結(jié)線蟲致死效果和對卵孵化的抑制效果已有很多報到，大部分都集中在鏈霉菌屬，例如：密旋鏈霉菌（S.pactum）和婁徹氏鏈霉菌（S.rochei）、針孢鏈霉菌（S.aculeolatus）、淡紫灰鏈霉菌MZ11、灰肉紅鏈霉菌HA0701、紅灰鏈霉菌HDZ?9?47等[19,22?23]。已經(jīng)用于商業(yè)化的阿維菌素、尼克霉素等也是由鏈霉菌產(chǎn)生。本試驗篩選出的放線菌發(fā)酵液原液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有較高的致死率，其原因可能有兩個方面：（1）次級代謝產(chǎn)物中具有殺線活性的物質(zhì)使線蟲受到毒害。（2）菌體或孢子本身對線蟲具有寄生作用進而殺死線蟲。目前，除蟲鏈霉菌代謝產(chǎn)物中的大環(huán)內(nèi)酯化合物已進行商業(yè)化開發(fā)，本試驗中放線菌發(fā)酵液次級代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)及對線蟲的作用機制還需進一步探究。

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The 16S rDNA electrophoretogram of the LY4

圖3 以16S rDNA為基礎構(gòu)建的LY4菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LY4 based on 16S rDNA sequence

在土壤穩(wěn)定性試驗中，菌株LY4的防效為71.10%，其效果好于玫瑰暗黃鏈霉菌的52.80%，推測可能是與灌根施加的發(fā)酵液原液的量有關。在離體生測試驗中效果最好的是菌株GT6，但在土壤穩(wěn)定性試驗中表現(xiàn)卻并不突出，所以在實驗室內(nèi)有良好抑制效果的菌株未必在土壤復雜的微生物環(huán)境中依然良好，而在實驗室內(nèi)抑制效果一般的菌株也可能在土壤復雜的微生物環(huán)境中表現(xiàn)良好。本試驗所篩選出的放線菌菌株LY4雖然在體外生測試驗和溫室小盆栽試驗中對根結(jié)線蟲具有一定的防治作用，但在大田試驗中是否有比較好的效果，還需進一步深入探究。