翟 睿 張學(xué)金 周小凡

（1.浙江科技學(xué)院浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310023；2.南京林業(yè)大學(xué)江蘇省制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210037）

化石能源屬不可再生資源[1]，在使用過程中所生成的燃燒產(chǎn)物會(huì)造成大氣污染，因此對(duì)可再生綠色能源的開發(fā)以及利用，并用該類能源替代化石能源這一方向受到了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。在該背景下，對(duì)生物乙醇這一可再生綠色能源的研發(fā)和利用受到了廣泛關(guān)注[2]。

在早期的研發(fā)過程中，人們主要以面粉、大米以及玉米等糧食資源作為原料制備生物乙醇，但目前多以農(nóng)業(yè)廢棄物（如稻草秸稈、麥草秸稈）作為替代物，具體的流程包括原料預(yù)處理、生物酶解、酶解液的發(fā)酵以及發(fā)酵產(chǎn)物的提純等[3-4]，其中原料預(yù)處理的作用最為關(guān)鍵，因此如何提高原料預(yù)處理效率這一課題受到了廣泛關(guān)注[5]。

農(nóng)業(yè)廢棄物屬于低利用率資源，而在制漿造紙工業(yè)中，木材原料的枝材同樣屬于低利用率資源（樹干為高利用率資源），但相關(guān)研究表明，枝材的制漿性能和干材大致相當(dāng)，可用于制漿的生產(chǎn)[6]，此外樹干纖維可用于生物乙醇的制備，因此可以推測(cè)，枝材纖維也可起到類似的作用。

氫氧化鈉-尿素水溶液是在低溫條件下溶解纖維素纖維制備纖維素材料的溶劑[7]，但利用該溶劑處理枝材纖維進(jìn)而改善其生物酶解性能這一方向鮮有報(bào)道。依前期探索，筆者發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉-尿素水溶液可有效改善木質(zhì)纖維素纖維的酶解性能[8-9]，原因在于：在低堿濃和低用堿量的條件下，氫氧化鈉可以實(shí)現(xiàn)纖維無定形區(qū)的部分潤脹進(jìn)而使纖維得到軟化，在纖維潤脹度增加的同時(shí)，尿素可進(jìn)一步軟化纖維（分子中的氨基可起到上述作用），隨著纖維潤脹度和軟化度的提高，其反應(yīng)活性得到改善，這有利于纖維化學(xué)組分在預(yù)處理過程中的脫除；在預(yù)處理過程中，隨著溫度的升高，氫氧化鈉對(duì)木質(zhì)素的脫除能力增強(qiáng)，同時(shí)尿素在氫氧根存在的環(huán)境下可部分水解而轉(zhuǎn)化為氨，這有利于木質(zhì)素發(fā)生氨解而促進(jìn)其脫除，而木質(zhì)素可屏蔽碳水化合物和生物酶的有效接觸進(jìn)而降低酶解效率；此外筆者還發(fā)現(xiàn)堿脲體系中氫氧化鈉-硫脲-尿素水溶液的處理效果最好，但硫脲在預(yù)處理過程中容易生成含硫的污染物質(zhì)。鑒于上述分析，本研究利用氫氧化鈉-尿素水溶液在高溫條件下處理桉木枝材纖維以求改善其生物酶解性能，用單因素實(shí)驗(yàn)探究最佳處理工藝，考察了該溶劑的處理效果。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料的準(zhǔn)備

取足量去皮桉樹枝材木片（產(chǎn)自廣東），用溫水浸泡洗滌以除去其中灰塵等雜質(zhì)，隨后濃縮至20%的濃度，用磨漿機(jī)將其磨解成粗漿并經(jīng)充分篩選后得到細(xì)漿，收集全部細(xì)漿，離心脫水后搓散并室溫風(fēng)干（該風(fēng)干漿簡稱“原纖維”），待水分平衡后測(cè)定固含量備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品的準(zhǔn)備

將氫氧化鈉、尿素和去離子水按6∶4∶90 的質(zhì)量比[10]混合均勻并制成水溶液，密封靜置保存以穩(wěn)定濃度。

分別將纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶用pH值=4.8 的醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解完全并按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定各自的酶活，完成后按1∶1.2∶1（纖維素酶∶木聚糖酶∶纖維二糖酶）的酶活比[11]將3 種酶溶液混合，調(diào)節(jié)混合液的酶活（以纖維素酶的酶活計(jì)）為20 FPU/mL，于4℃條件下靜置密封保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原纖維的組分含量檢測(cè)

取適量原纖維，用纖維粉碎機(jī)粉碎，篩選后取40～60 目的組分，按國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定苯-醇抽出物含量（GB/T 10741—2008）、木質(zhì)素（酸不溶和酸溶木質(zhì)素含量測(cè)定分別參照GB/T 747—2003 和GB/T 10337—2008，將酸不溶木質(zhì)素含量和酸溶木質(zhì)素含量相加得到總木質(zhì)素含量）和綜纖維素（測(cè)定參照GB/T 2677.10—1995）的百分含量。取檢測(cè)木質(zhì)素含量時(shí)得到的硫酸水解液，用高效液相色譜檢測(cè)其中葡萄糖、木糖和甘露糖的絕對(duì)含量并折算成占原料絕干質(zhì)量的百分比（簡稱“含量”），將單糖含量換算成相應(yīng)的聚糖含量并相加得到原纖維中的總糖含量[12]。

1.2.2 原纖維的化學(xué)預(yù)處理

取一定量的原纖維置于蒸煮罐中，加入氫氧化鈉-尿素水溶液，用清水調(diào)至液比1∶4 并加入蒽醌，將蒸煮罐置于蒸煮器中，空轉(zhuǎn)15 min 使藥液浸漬完全，隨后按2℃/min 的速率升至最高溫并保溫一段時(shí)間使反應(yīng)完全，完成后將纖維洗凈，離心脫水后搓散并稱量，記為處理后纖維，平衡水分后測(cè)定固含量以計(jì)算預(yù)處理得率。

1.2.3 處理后纖維的組分含量分析

取適量處理后纖維，室溫風(fēng)干，將纖維粉碎篩選后取40～60 目間的組分，用同樣的方法測(cè)定其中苯-醇抽出物、木質(zhì)素和綜纖維素的百分含量，其脫除率的計(jì)算見公式（1）。

式中，M表示原纖維中組分含量；M′表示處理后纖維中的組分含量，d表示預(yù)處理得率。

1.2.4 處理后纖維的酶解性能分析

將處理后纖維中大于60 目的粉末再次篩選并取大于100目的組分，平衡水分后測(cè)定固含量，隨后取相當(dāng)于2 g 絕干質(zhì)量的粉末于100 mL 碘量瓶中，加入混合酶溶液（混合酶的用量為10 FPU/g底物，以纖維素酶的酶活計(jì)），補(bǔ)充醋酸-醋酸鈉緩沖溶液至5%的酶解濃度，加入適量四環(huán)素以防止微生物污染，將碘量瓶密封后在150 r/min和50℃的條件下振蕩72 h，隨后將酶解液在沸水浴中滅活，將得到的懸浮液真空抽濾并用熱水洗滌濾餅以收集全部單糖，抽濾液經(jīng)蒸發(fā)濃縮后用高效液相色譜檢測(cè)其中單糖含量，再將單糖含量折算成相應(yīng)的聚糖含量，將聚糖含量相加后得到處理后纖維中的酶解總糖含量并計(jì)算總糖轉(zhuǎn)化率，經(jīng)綜合分析后確定最佳工藝條件。糖含量的計(jì)算方法如下。

（1）原纖維中六碳聚糖質(zhì)量=硫酸水解液中六碳單糖質(zhì)量×0.9；原纖維中五碳聚糖質(zhì)量=硫酸水解液中五碳單糖質(zhì)量×0.88；原纖維中六碳聚糖含量=原纖維中六碳聚糖質(zhì)量/用于測(cè)定木質(zhì)素含量的原纖維的絕干質(zhì)量×100%；原纖維中五碳聚糖含量=原纖維中五碳聚糖質(zhì)量/用于測(cè)定木質(zhì)素含量的原纖維的絕干質(zhì)量×100%；

（2）被酶解的六碳聚糖質(zhì)量=酶解液中六碳單糖質(zhì)量×0.9；被酶解的五碳聚糖質(zhì)量=酶解液中五碳單糖質(zhì)量×0.88；被酶解的六碳聚糖含量=被酶解的六碳聚糖質(zhì)量/和用于酶解的處理后纖維質(zhì)量相對(duì)應(yīng)的原纖維的絕干質(zhì)量（該質(zhì)量=用于酶解的處理后纖維粉末的絕干質(zhì)量/處理得率，本研究中，用于酶解的處理后纖維粉末的絕干質(zhì)量恒定為2 g）×100%；被酶解的五碳聚糖含量=被酶解的五碳聚糖質(zhì)量/和用于酶解的處理后纖維質(zhì)量相對(duì)應(yīng)的原纖維的絕干質(zhì)量×100%；總糖轉(zhuǎn)化率=酶解總糖含量/原纖維總糖含量×100%。

1.2.5 氫氧化鈉-尿素水溶液處理效率評(píng)價(jià)

用清水替代氫氧化鈉-尿素水溶液，在上述最佳工藝條件下處理原纖維，完成后用同樣的方法檢測(cè)上述所有性能指標(biāo)并作為空白值，考察氫氧化鈉-尿素水溶液的處理效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 原纖維組分含量分析

原纖維組分含量如表1所示。

表1 原纖維化學(xué)組分含量分析 %

由表1 可知，原纖維中的總糖含量低于綜纖維素含量，這是由于闊葉木半纖維素中含有糖醛酸基和甲氧基，這些基團(tuán)易在硫酸水解過程中從半纖維素的主鏈上脫落，同時(shí)酸水解過程中會(huì)有部分單糖轉(zhuǎn)化為糠醛類物質(zhì)[13]，而糖醛酸類物質(zhì)、甲氧基類物質(zhì)和糠醛類物質(zhì)無法被高效液相色譜檢出，因此總糖含量低于綜纖維素含量。

2.2 用堿量的影響

用堿量對(duì)纖維化學(xué)組分含量的影響如表2 所示，用堿量對(duì)纖維化學(xué)組分脫除率的影響如圖1所示。

表2 用堿量對(duì)纖維化學(xué)組分含量的影響 %

圖1 用堿量對(duì)纖維化學(xué)組分脫除率的影響

由表2 和圖1 可知，隨著用堿量的增加（處理溫度145℃，保溫時(shí)間40 min），苯-醇抽出物和木質(zhì)素的含量降低，綜纖維素含量增加，同時(shí)3種組分的脫除率隨用堿量的增加而增加。

苯-醇抽出物、木質(zhì)素、纖維素和半纖維素均屬于堿溶性物質(zhì)，用堿量越高，混合體系中的堿濃越高，而堿濃越高，組分越容易被脫除，所以4種組分的脫除率均增加；綜纖維素含量反映纖維素含量和半纖維素含量的總和，因此綜纖維素的脫除率增加。隨著脫除率的增加，更多的苯-醇抽出物和木質(zhì)素得以有效降解，這也使得處理后纖維中這兩種物質(zhì)的含量降低；纖維素和半纖維素也屬堿溶性物質(zhì)，但化學(xué)反應(yīng)活性遠(yuǎn)不如苯-醇抽出物或木質(zhì)素高，這也是處理過程中存在組分選擇性脫除的主要原因。因此綜纖維素的脫除率比苯-醇抽出物或木質(zhì)素低很多[14]，即處理后纖維中纖維素和半纖維素的絕對(duì)含量（質(zhì)量）逐漸降低，但其百分含量增加，從而使綜纖維素的含量隨著用堿量的增加而增加。

用堿量對(duì)纖維酶解性能的影響如表3 所示。由表3 可知，隨著用堿量的增加（處理溫度145℃，保溫時(shí)間40 min），處理后纖維中被酶解的葡聚糖以及木聚糖和甘露聚糖的含量增加，但當(dāng)用堿量高于11%時(shí)，被酶解的聚糖含量降低。

表3 用堿量對(duì)纖維酶解性能的影響 %

在較低用堿量的條件下，由于堿溶液對(duì)木質(zhì)素脫除的選擇性較好，纖維素和半纖維素等碳水化合物沒有顯著降解，這也保證了處理后纖維中可發(fā)生酶解的聚糖含量不受明顯影響；同時(shí)堿溶液幾乎全部消耗于苯-醇抽出物和木質(zhì)素的降解以及纖維的潤脹，由于部分木質(zhì)素和苯-醇抽出物存在于纖維表面，對(duì)碳水化合物起阻隔作用，即木質(zhì)素的脫除有利于促進(jìn)碳水化合物與酶溶液的有效接觸；此外氫氧化鈉-尿素水溶液對(duì)纖維的潤脹能力強(qiáng)，而纖維潤脹度越高，其體積越大，這利于酶溶液對(duì)纖維的浸透以及進(jìn)一步促進(jìn)碳水化合物與酶溶液的接觸和纖維酶解性能的改善，纖維酶解性能越好，被酶解的聚糖含量越高[15]，因此被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量增加。

在高用堿量的條件下，堿溶液對(duì)木質(zhì)素脫除的選擇性變差，碳水化合物在木質(zhì)素被大量脫除的同時(shí)會(huì)發(fā)生更為明顯的降解，處理后纖維中可酶解的總糖質(zhì)量顯著降低，這也導(dǎo)致被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖含量的降低。綜上，選擇11%的用堿量作為后續(xù)研究基準(zhǔn)。

2.3 處理溫度的影響

處理溫度對(duì)纖維化學(xué)組分含量的影響如表4所示，處理溫度對(duì)纖維化學(xué)組分脫除率的影響如圖2所示。

由表4 和圖2 可知，隨著處理溫度的增加（用堿量11%，保溫時(shí)間40 min），苯-醇抽出物和木質(zhì)素的含量降低，綜纖維素含量增加，同時(shí)3種組分的脫除率隨處理溫度的增加而增加。

表4 處理溫度對(duì)纖維化學(xué)組分含量的影響

圖2 處理溫度對(duì)纖維化學(xué)組分脫除率的影響

反應(yīng)溫度越高，化學(xué)反應(yīng)速率越大，纖維化學(xué)組分越容易被脫除，苯-醇抽出物、木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解程度越高，脫除率越大。隨著脫除率的增加，苯-醇抽出物和木質(zhì)素的含量降低，由于纖維素和半纖維素的化學(xué)反應(yīng)活性不如苯-醇抽出物或木質(zhì)素高，因此這兩種物質(zhì)的脫除率低，這也導(dǎo)致綜纖維素的含量增加。

處理溫度對(duì)纖維酶解性能的影響如表5 所示。由表5 可知，隨著處理溫度的增加（用堿量11%，保溫時(shí)間40 min），處理后纖維中被酶解的葡聚糖以及木聚糖和甘露聚糖的含量增加，但當(dāng)處理溫度高于140℃時(shí)，被酶解的聚糖含量降低。

表5 處理溫度對(duì)纖維酶解性能的影響

處理溫度越高，越有利于苯-醇抽出物和木質(zhì)素的脫除，進(jìn)而增加暴露于纖維表面的碳水化合物的含量并促進(jìn)其與生物酶的接觸以及酶解的進(jìn)行；同時(shí)隨著處理溫度的提高，纖維的潤脹度提高，有利于酶溶液對(duì)纖維的浸透，這同樣促進(jìn)了纖維酶解性能的改善，因此處理后纖維中被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量隨著處理溫度的增加而增加。但當(dāng)處理溫度過高時(shí)，碳水化合物的水解反應(yīng)變得劇烈（較低溫度的條件下僅發(fā)生剝皮反應(yīng)而不能發(fā)生水解反應(yīng)），纖維素和半纖維素的脫除率增加，處理后纖維中可酶解聚糖的質(zhì)量顯著降低，這不利于生物酶解的進(jìn)行，因此處理后纖維中被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量降低。綜上，選擇140℃的處理溫度作為后續(xù)研究基準(zhǔn)。

2.4 保溫時(shí)間的影響

保溫時(shí)間對(duì)纖維化學(xué)組分含量的影響如表6 所示，保溫時(shí)間對(duì)纖維化學(xué)組分脫除率的影響如圖3所示。

表6 保溫時(shí)間對(duì)纖維化學(xué)組分含量的影響

圖3 保溫時(shí)間對(duì)纖維化學(xué)組分脫除率的影響

由表6 和圖3 可知，隨著保溫時(shí)間的增加（用堿量11%，處理溫度140℃），處理后纖維中苯-醇抽出物和木質(zhì)素的含量降低，綜纖維素含量增加，同時(shí)3種組分的脫除率隨保溫時(shí)間的增加而增加。

木材原料中木質(zhì)素的大量脫除需要在高溫條件下進(jìn)行（蒸煮時(shí)一般要求處理溫度高于150℃），此外組分脫除和纖維潤脹均非瞬間或短時(shí)間內(nèi)完成，因此保溫在木材原料的化學(xué)蒸煮過程中不可缺失。本研究所用枝材纖維屬木材原料，盡管酶解前的化學(xué)預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素脫除率的要求低于化學(xué)漿蒸煮的要求，但仍要求木質(zhì)素得到明顯的脫除，因此保溫操作在本研究中予以采用。隨著保溫時(shí)間的增加，纖維化學(xué)組分得到脫除，苯-醇抽出物、木質(zhì)素和綜纖維素的脫除率增加，處理后纖維中苯-醇抽出物和木質(zhì)素的含量降低，由于纖維素和半纖維素化學(xué)反應(yīng)活性低，綜纖維素含量增加。

表7 為保溫時(shí)間對(duì)纖維酶解性能的影響。由表7可知，隨著保溫時(shí)間的增加（用堿量11%，處理溫度140℃），葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量增加，但當(dāng)保溫時(shí)間長于50 min時(shí)，被酶解的聚糖含量降低。

原料中的木質(zhì)素組分在升溫階段的脫除比例相對(duì)較低，因此需要借助最高溫條件下的保溫過程方可實(shí)現(xiàn)明顯的脫除。隨著保溫時(shí)間的增加，木質(zhì)素的脫除率逐漸增加，暴露于處理后纖維表面的碳水化合物的含量增加，同時(shí)纖維潤脹度和體積增加，這利于改善纖維與生物酶的接觸效率以及纖維酶解性能的改善，因此處理后纖維中被酶解的葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖以及酶解總糖含量增加。保溫時(shí)間過長時(shí)，堿溶液對(duì)木質(zhì)素脫除的選擇性變差，此時(shí)碳水化合物的降解比例增加，處理后纖維中可酶解聚糖含量顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致處理后纖維中被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量降低。綜上，選擇50 min的保溫時(shí)間作為最佳工藝條件。

表7 保溫時(shí)間對(duì)纖維酶解性能的影響

表8 纖維化學(xué)組分含量和纖維酶解性能分析 %

2.5 纖維化學(xué)組分含量和纖維酶解性能分析

經(jīng)熱水處理后的纖維（WF，處理溫度140℃，保溫時(shí)間50 min，浸漬時(shí)間15 min、液比1∶4）和經(jīng)氫氧化鈉-尿素水溶液處理后的纖維（SUF，用堿量11%，處理溫度140℃，保溫時(shí)間50 min，浸漬時(shí)間15 min、液比1∶4）的組分含量和酶解性能如表8所示。

由表8 可知，經(jīng)氫氧化鈉-尿素水溶液處理后纖維中苯-醇抽出物和木質(zhì)素含量與經(jīng)熱水處理后纖維相比降幅明顯，同時(shí)被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖含量以及酶解總糖的含量和總糖轉(zhuǎn)化率顯著增加。其總糖含量為50.9%，總糖轉(zhuǎn)化率為81.18%。這表明氫氧化鈉-尿素水溶液可有效脫除原料中的苯-醇抽出物和木質(zhì)素等組分，使更多的纖維素和半纖維素組分暴露于纖維表面，此外該溶劑可以潤脹纖維，增加纖維的體積，促進(jìn)纖維和酶溶液的有效接觸，進(jìn)而改善纖維的酶解性能。

3 結(jié) 論

3.1 利用氫氧化鈉-尿素水溶液在高溫條件下改善桉木枝椏纖維酶解性能的最佳工藝為：用堿量11%（以氫氧化鈉計(jì)）、處理溫度140℃、保溫時(shí)間50 min。

3.2 在最佳工藝條件下，纖維中苯-醇抽出物、木質(zhì)素和綜纖維素的脫除率分別為64.59%、56.45%和15.20%，纖維的酶解總糖含量和總糖轉(zhuǎn)化率分別為50.9%和81.18%，與經(jīng)熱水處理后纖維的上述兩項(xiàng)指標(biāo)相比分別提高了約133.5%。

3.3 氫氧化鈉-尿素水溶液在合適的高溫條件下可效脫除纖維中的木質(zhì)素組分，同時(shí)對(duì)聚糖組分的降解十分有限，這利于保證纖維中可酶解聚糖含量并促進(jìn)纖維酶解性能的改善。