高豐琴，陳曉麗，郭向宇，牟 萱

（1.咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710062）

生物酶因其獨特的催化性能被廣泛應(yīng)用，生物酶的固定化也由于能提高生物酶的操作穩(wěn)定性、對催化環(huán)境的耐受性及重復(fù)使用性等在很多研究領(lǐng)域中被持續(xù)關(guān)注[1]。在固定化酶研究方面，載體的選擇關(guān)系著固定化的成敗及固定化酶的使用效果。納米金粒子因其具有獨特的光學(xué)性質(zhì)、化學(xué)活性、電學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性等優(yōu)點[2]，且納米金粒子易與蛋白分子中游離的氨基和巰基作用，可通過表面的疏水作用及靜電作用等將蛋白固定在表面。這種生物快速固定化的特點使納米金粒子在生物傳感、固定化酶催化等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[3,4]。磁性Fe3O4納米粒子由于其形狀各向異性、易于磁場調(diào)節(jié)和獨特的磁性能，同樣有著廣泛的應(yīng)用前景。

但磁性Fe3O4的理化性質(zhì)容易受到外界環(huán)境的影響（比如被酸堿破壞或被氧化變質(zhì)等）而降低了其在使用過程中的穩(wěn)定性。與此同時，磁性Fe3O4納米粒子具有非?；钴S的表面，可以方便地吸附貴金屬，而且Fe3O4能有效地提高貴金屬的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性[5]。因此，在磁性Fe3O4納米粒子上包覆一層金，可以改善其生物相容性和穩(wěn)定性，防止氧化且使表面易于功能化[6]。

本文合成了具有磁性吸附性能和良好生物相容性的Au@Fe3O4復(fù)合載體材料，通過親和素-生物素的特異性結(jié)合固定化氯過氧化物酶。通過優(yōu)化Au@Fe3O4固定化酶時溫度、時間和緩沖溶液pH 值條件，使固定化達到最大固載量。研究中以2-氯-5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮的氯化反應(yīng)為模型反應(yīng)，考察固定化酶的重復(fù)使用性，為固定化酶的使用提供一定理論研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯過氧化物酶（陜西師范大學(xué)大分子科學(xué)陜西省重點實驗室提供）；2-氯-5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮（Sigma-Aldrich 公司）；生物素酰肼（蘇州昊帆生物科技有限公司）；鏈霉親和素（北京索萊寶科技有限公司）；FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；鹽酸羥胺、NaOH、K2HPO4、KH2PO4、HAuCl4（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；H3PO4、H2O2（西安化學(xué)試劑廠）。

UV-1750 型紫外可見分光光度計（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；LSHZ-300 型冷凍恒溫水浴振蕩器（蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司）；D/Max2550VB+/PC 型 X 射線衍射儀（XRD）（日本理學(xué)公司）。

1.2 Au@Fe3O4 載體的制備

將 FeCl2·4H2O 和 FeCl3·6H2O 以 2.7∶1 的質(zhì)量比溶解于蒸餾水中，通Ar 條件下向其中滴加NaOH溶液。反應(yīng)1h 后，用超純水反復(fù)洗滌固體，干燥研磨后得到 Fe3O4。取 8.0mg·mL-1的 Fe3O4種子懸浮液，加入0.1%的HAuCl4水溶液，振蕩混合30min。然后加入0.2mol·L-1還原劑鹽酸羥胺，反應(yīng)1h 后經(jīng)磁性分離即得到Au@Fe3O4復(fù)合納米粒子。

1.3 Au@Fe3O4 固定化氯過氧化物酶

取0.25mg 金磁納米粒子，加入1.0mg·mL-1鏈霉親和素，加入pH 值為5.0 的K2HPO4-KH2PO4緩沖液1.0mL，超聲10min 后即得到Au@Fe3O4固定化鏈霉親和素。取2.7×10-7mol 的氯過氧化物酶（CPO）和1.90mg 的生物素酰肼溶于pH 值為 5.0 的緩沖溶液中配置成4.0mL 溶液，于室溫中攪拌3h 后靜置24h。得到的生物素標記CPO。

取0.25mg 上述已制備好的鏈霉親和素功能化的Au@Fe3O4納米粒子，向其中加入20μL 生物素標記的CPO，在冷凍恒溫水浴振蕩器中以200r·min-1反應(yīng)一定時間，得到固定化CPO（Au@Fe3O4-CPO）。用紫外分光光度計測定固定化前后上清液在398nm的吸光度值，計算生物素標記CPO 在Au@Fe3O4納米粒子表面的固載量。

1.4 固定化酶的重復(fù)使用性

CPO 酶活性通過催化2-氯-5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮（MCD）生成2,2-二氯-5,5-二甲基-1,3-環(huán)己二酮（DCD）的氯化反應(yīng)來測定[7]。Au@Fe3O4-CPO 固定化酶的重復(fù)使用性，用酶催化MCD 氯化反應(yīng)來表征。對于固定化CPO 的催化活性，將第一次使用固定化酶的氯化活性看作是100%，并把以后每一次的活性與之相比，同樣以殘余活性來表示。每次反應(yīng)完成后，將反應(yīng)體系磁性分離，并將固定化酶催化劑繼續(xù)用于下一次的氯化反應(yīng)體系。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au@Fe3O4 納米粒子的表征

圖1a 為 Au@Fe3O4的 X-射線衍射分析（XRD）圖譜，圖1b 為Au@Fe3O4在pH 值為3.5 緩沖溶液中的穩(wěn)定性。

圖1 Fe3O4 和 Au@Fe3O4 的 XRD（a）和 Au@Fe3O4在pH 值3.5 緩沖溶液中的穩(wěn)定性（b）Fig.1 XRD patterns of Fe3O4 and Au@Fe3O4（a）and Au@Fe3O4 stability in pH 3.5 buffer solution（b）

由圖 1a 可知，衍射角 2θ 分別為 38.1°、44.4°、64.5°和77.5°處出現(xiàn)的衍射特征峰，分別對應(yīng)為Au的（111）、（200）、（220）和（311）晶面，與標準圖譜數(shù)據(jù)（JCPDS 04-0784）基本一致，金殼層為立方結(jié)構(gòu)，而復(fù)合材料中Fe3O4組分的各衍射峰30.1°、35.7°，57.2°和 62.8°，符合標準圖譜數(shù)據(jù)（JCPDS 65-3107），表明合成載體組分是由Au 粒子和Fe3O4構(gòu)成，且Au@Fe3O4載體材料中金的衍射峰強度強于Fe3O4，表明合成的Au@Fe3O4為核-殼型納米復(fù)合材料[8]。

由圖1b 可以看出，當施加外部磁場后，Au@Fe3O4被迅速吸引至磁鐵處，可見Au@Fe3O4能從反應(yīng)體系中快速分離。Au@Fe3O4在pH 值為3.5的緩沖液中振蕩3h，磁性分離后測上清液的紫外吸收。由圖1b 可知，上清液澄清，上清液和PBS 緩沖液的紫外吸收差別不大，表明Au@Fe3O4復(fù)合材料在pH 值為3.5 的酸性介質(zhì)中比較穩(wěn)定，可以作為固定化CPO 酶的優(yōu)良載體。

2.2 酶固定化條件優(yōu)化

由固定化溫度條件探討發(fā)現(xiàn)（圖2a），在4～25℃范圍內(nèi)，溫度的變化對固定化CPO 固載量的影響不是很大，這與生物素與鏈霉親和素的特異性結(jié)合有關(guān)（Kd≈10-15M）[9]。

固定化時間上，生物素化CPO 能較快地與載體材料結(jié)合，由圖2b 可知，Au@Fe3O4固定CPO 的最佳固定時間為40min，時間超過40min 后至60min內(nèi)，固載量下降并不明顯。由于固定化是在振蕩器中進行的，如果固定時間過長的話，由于外界的機械振動CPO 容易從載體上脫落，從而導(dǎo)致固載量降低。但在本實驗中，固定化過程是實現(xiàn)生物素與鏈霉親和素的對接，這種特異性結(jié)合使得酶分子的脫落并不十分容易發(fā)生。

在固定化溫度為10℃，固定化時間為40min 的條件下，只改變PBS 緩沖液的pH 值來進行氯過氧化物酶的固定化。

由圖2c 中數(shù)據(jù)分析可知，pH 值對氯過氧化物酶的固定化的影響相對溫度和反應(yīng)時間比較顯著。隨著pH 值的變化，氯過氧化物酶的固載率有很大的差別，pH 值為3.0 時，固載量最大，此時的pH 值即為氯過氧化物酶的固定化的最佳pH 值。

圖2 Au@Fe3O4 固定化CPO 的條件Fig.2 Conditions for the immobilization of CPO with Au@Fe3O4

2.3 固定化酶的重復(fù)使用性

圖3 是固定化CPO 催化MCD 氯化反應(yīng)中的重復(fù)使用情況。

圖3 固定化CPO 的重復(fù)使用次數(shù)Fig.3 Reusability of immobilized CPO

由圖3 可以看出，Au@Fe3O4CPO 固定化酶的重復(fù)使用性較好，重復(fù)使用6 次酶殘余活性保留仍在70%以上。這可能是由于親和素-生物素特異性結(jié)合系統(tǒng)使CPO 的固定化較為牢固，固定化CPO 不容易發(fā)生脫附或泄漏，可達到多次重復(fù)使用的目的。

3 結(jié)論

合成了易于從液相反應(yīng)體系中分離的Au@Fe3O4復(fù)合材料，將Au@Fe3O4作為磁性載體材料用于固定化氯過氧化物酶。通過單因素實驗，優(yōu)化得到Au@Fe3O4-CPO 的最佳固定條件為緩沖液pH 值為3.0、反應(yīng)時間40min、溫度10℃。固定化CPO 的表現(xiàn)出良好的重復(fù)使用性，重復(fù)使用6 次酶殘余活性保留仍在70%以上。