申維維，吳 瓊，胡 迪，吳顯平，溫海京，胡 婷，范礦士，張永紅，崔德鳳

(北京農學院動物科學技術學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室/動物類國家級實驗教學示范中心，北京102206)

隨著人們生活質量的提高，畜牧業(yè)產品的安全問題越來越受到重視。目前中國畜牧養(yǎng)殖生產中仍存在對抗生素、化學藥物、激素等超量且不合理使用現象，長期下來致使畜禽產品安全性降低[1]，特別是采食抗生素的動物體內會形成大量抗性基因，這種基因會隨著動物糞便污染周邊環(huán)境甚至土壤進入生物鏈，經過食物鏈進入人體，間接對人類健康形成威脅，抗生素的耐藥性及其在動物產品中的殘留威脅人類健康。益生菌作為一種優(yōu)勢菌，屬于對宿主有益的活性微生物，不僅可以調節(jié)腸道內微生物體系，還能保護機體腸道不受侵害[2]，在腸道中扮演十分重要的角色。凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，BC)擁有乳酸菌類益生菌與芽孢菌類益生菌兩類的共同優(yōu)點[3]，可以保存較長時間，在室溫且避光的環(huán)境中其有效作用可長達720 d，主要具有耐熱、耐氧、耐鹽、耐酸堿等“四耐”的抗逆特性[4-5]。益生菌作為抗生素的潛在替代品已經成為研究熱點，郭欣怡等[6]在肉仔雞飼喂中加入益生菌，益生菌組肉雞免疫器官質量與系數增加且顯著高于空白對照組，益生菌提高肉仔雞的免疫功能。劉淑嬌等[7]在肉雞基礎日糧中添加復合益生菌，益生菌組肉雞血清中總蛋白和免疫球蛋白IGg含量顯著增加。該試驗以肉雞為研究對象，其飼養(yǎng)過程中飼料中分別添加凝結芽孢桿菌和抗生素，以抗生素為參照，探討凝結芽孢桿菌對肉雞免疫功能的影響，目的為實際養(yǎng)殖中抗生素的使用尋找替代品提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，BC)由北京農學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室保存，3日齡健康雄性肉雞購自北京愛拔益加家禽育種有限公司，雞IL-10和雞IgG試劑盒購自雨桐生物公司，D-Hank's購自Gibco公司，淋巴細胞分離液購自biowest公司，1640培養(yǎng)液購自博爾優(yōu)生物公司，MTT購自Millipore，刀豆蛋白(ConA)購自索萊寶公司。

超凈工作臺(東聯哈爾制造公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器公司)、酶標儀(北京普朗新技術有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗分組與肉雞飼養(yǎng) 取肉雞75只經過3 d適應性飼養(yǎng)后隨機分5組，即空白對照組、抗生素組、BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組?？瞻讓φ战M肉雞飼喂基礎日糧，抗生素組肉雞飼喂基礎日糧加桿菌肽(4 g/10 kg)，BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞飼喂基礎日糧加凝結芽孢桿菌(活菌數分別為2×107、2×108、2×109CFU/mL)。每組3個重復。試驗采用無抗生素添加的基礎日糧(表1)，試驗周期為35 d，7 d為一個周期。

1.2.2 肉雞飼養(yǎng)管理 購進試驗肉雞之前對雞舍進行全面沖洗、消毒，進雛雞前2 d對雞舍進行照射升溫。肉雞分層飼養(yǎng)，每天人工給料1次，自由采食，自由飲水，雞舍內照射熱燈，保障雞舍內適宜的溫度和濕度，注意保障雞舍衛(wèi)生及合理通風。

1.2.3 樣品采集與檢測 試驗期第7天、第14天、第21天、第28天、第35天時對肉雞稱量體質量，同時每組取3只肉雞心臟采血3～4 mL分別置于一支含有抗凝劑(肝素)采血管(用于T淋巴細胞提取)和另一只不加肝素采血管，不加肝素采血管室溫

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Basic diet composition and nutrition level

斜面放置0.5 h，3 000 r/min離心10 min，吸取血清置于滅菌1.5 mL EP管內，采用血清生理生化分析儀檢測生理生化相關指標，按照試劑盒說明操作檢測血清中IL-10和IgG含量。

剖殺肉雞取出脾臟、胸腺、法氏囊，用濾紙輕輕擦拭表面稱量質量，按照公式計算臟器指數=臟器質量(g)/肉雞體質量(g)。

1.2.4 T淋巴細胞轉化率測定 取1 mL的Hanks液于離心管中，加入1 mL全血混勻，將其緩慢加入裝有2 mL淋巴分離液離心管內，2 000 r/min離心20 min，取出離心管用毛細管吸取中間層白色絮狀裝于有15 mL 1640培養(yǎng)液離心管中，2 000 r/min離心5 min，用1640培養(yǎng)液洗滌，離心，重復2次，棄去培養(yǎng)液，最后用1640培養(yǎng)液將細胞稀釋到2×106個/mL，加入96孔細胞培養(yǎng)板，空白對照孔加入50 μL細胞懸液+50 μL的1640培養(yǎng)液，試驗組孔加入50 μL細胞懸液+50 μL的ConA，置于細胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，取出細胞板每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加DMSO溶液100 μL，將細胞板置于酶標儀460 nm下檢測，記錄吸光度值。

1.2.5 數據統(tǒng)計分析 應用SPSS 20.0軟件對試驗數據進行分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異非常顯著，文中與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與抗生素組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

2 結 果

2.1 凝結芽孢桿菌對肉雞體質量和免疫器官指數的影響

凝結芽孢桿菌對肉雞體質量和免疫器官指數的影響見圖1和表2。試驗期14 d時BC高劑量組肉雞日增體質量顯著高于抗生素組(P<0.05)，試驗期21 d時抗生素組、BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞日增體質量均非常顯著高于空白對照組(P<0.001)，試驗期28 d時抗生素組和BC中劑量組肉雞日增體質量顯著高于空白對照組，試驗期35 d時 BC中劑量組肉雞日增體質量極顯著高于空白對照組(P<0.01)；整個試驗期內抗生素組與BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組相比肉雞日增體質量沒有顯著差異(P>0.05)。試驗前期第14 天之后抗生素組與BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組均表現出顯著提高肉雞平均日增體質量的作用，且隨著試驗期延長BC中劑量組肉雞日增體質量提高顯著，BC中劑量促進肉雞生長效果顯著。

試驗期21 d和28 d時，BC中劑量組肉雞法氏囊指數與空白對照組存在顯著差異，試驗期BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞法氏囊指數均高于抗生素組；試驗期14、21、28 d時BC中劑量組肉雞脾臟指數均顯著高于空白對照組，且在試驗期BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞脾臟指數均高于空白對照組；試驗期7、14、21、28 d時BC中劑量組胸腺指數顯著高于空白對照組，在試驗期BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組胸腺指數均高于空白對照組。

表2 凝結芽孢桿菌對肉雞免疫器官指數的影響Tab.2 Effects of Bacillus coagulans on immune organ index of broilers

2.2 凝結芽孢桿菌對肉雞T淋巴細胞轉化的影響

試驗期第7天、第14天時BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞血液T淋巴細胞培養(yǎng)72 h時，T淋巴細胞轉化率顯著提高(圖2A、圖2B)；試驗期14 d時BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞血液T淋巴細胞培養(yǎng)96 h時，T淋巴細胞轉化率繼續(xù)提高，且BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組T淋巴細胞轉化率均顯著高于空白對照組和抗生素組(圖2B)，隨著肉雞飼喂凝結芽孢桿菌時間延長，凝結芽孢桿菌對T淋巴細胞轉化的促進作用提高；試驗28 d時的T淋巴細胞培養(yǎng)48 h后轉化增加(圖2D)；試驗期21 d、35 d時，T淋巴細胞轉化率均有提高，其中BC低劑量組、BC高劑量組肉雞血液T淋巴細胞轉化率提高效果更顯著，BC中劑量同樣也有促進作用(圖2C、圖2E)。

2.3 凝結芽孢桿菌對肉雞血液生化指標的影響

試驗期間，肉雞血液生化指標空白對照組與抗生素組之間沒有顯著差異(P>0.05)，BC低劑量組丙氨酸氨基轉化酶活性顯著高于空白對照組(P<0.05)，BC高劑量組尿素含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)見表3。

2.4 凝結芽孢桿菌對肉雞血液細胞因子IL-10及抗體IgG水平的影響

試驗期14 d時BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞血清中IL-10含量達到最高值，且BC高劑量組IL-10含量最高，與空白對照組與抗生素組差異非常顯著(圖3)。試驗期14 d時BC高劑量組肉雞血清中IgG含量最高，與空白對照組差異顯著，隨著試驗時間延長，組間血清中IgG含量差異逐漸縮小(圖4)。

血液生化指標Blood biochemical index空白對照組Blank control group抗生素組Antibiotic groupBC低劑量組BC low dose groupBC中劑量組BC medium dose groupBC高劑量組BC high dose group丙氨酸氨基轉化酶ALT/(U/L)5.00±2.004.00±2.287.60±0.49*5.80±1.334.80±1.47谷草轉氨酶AST/(U/L)145.40±46.06153.40±19.20148.20±50.53148.40±52.10177.60±49.42堿性磷酸酶ALP/(U/L)1244.20±438.36941.40±167.171657.40±258.92892.00±323.03984.80±502.76總蛋白TP/(g/L)13.20±5.069.84±4.8313.34±4.6110.76±4.0614.56±7.88白蛋白ALB/(g/L)10.16±1.679.40±0.709.48±2.149.20±1.019.44±1.73尿素Urea/(mmol/L)0.80±0.130.90±0.061.00±0.140.94±0.191.38±0.21肌酐Crea(mmol/L)5.74±4.372.30±2.054.96±4.103.72±1.506.36±0.88**

3 討 論

無菌動物體內的淋巴器官發(fā)育遲緩，將其置于有菌環(huán)境中淋巴器官發(fā)育狀況有所好轉，體內正常的菌群結構有助于機體內免疫器官的發(fā)育[8]。該試驗期14、21、28 d時BC中劑量組肉雞免疫器官指數顯著增加，凝結芽孢桿菌可以提高肉雞免疫器官的發(fā)育，而試驗期35 d時BC中劑量組胸腺指數逐漸下降，這可能由于凝結芽孢桿菌在腸道中大量繁殖，肉雞前期飼養(yǎng)過程中凝結芽孢桿菌刺激免疫器官的生長發(fā)育，但隨著肉雞機體的發(fā)育成熟，免疫器官和消化器官的發(fā)育趨于穩(wěn)定，凝結芽孢桿菌刺激其生長發(fā)育的作用逐漸降低，與前人報道一致[9]。當機體內的淋巴細胞受到抗原等因素刺激，其會逐漸轉變成一種母細胞，這是淋巴細胞轉化的主要途徑[10]。淋巴細胞的轉化率是機體免疫水平的一把標尺，當淋巴細胞轉化率增強時，免疫細胞活性也會隨之增強，共同達到提高機體免疫水平的作用[11-12]。該試驗肉雞養(yǎng)殖過程中飼料中加入2×107CFU/mL和2×109CFU/mL凝結芽孢桿菌時，BC低劑量組、BC高劑量組肉雞T淋巴細胞轉化率提高，凝結芽孢桿菌提高肉雞免疫水平。IL-10屬于一種來源廣且功能多的細胞因子，IL-10是淋巴結、脾臟細胞生長的復合因子，其可有效抑制促炎因子的產生而抑制炎癥反應，促進免疫細胞的增殖分化[13]。機體血清中主要由免疫球蛋白IgG占比最多，這種免疫球蛋白占總含量的70%左右，通過檢測免疫球蛋白IgG的含量可以反映出機體免疫能力的強弱。該試驗中BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組14 d肉雞血清中IL-10含量高且免疫球蛋白IgG含量最高，凝結芽孢桿菌可以促進機體產生免疫球蛋白抗體的分泌，從而提高肉雞機體的免疫能力。

肝臟和腎臟分別是異源物質在機體進行轉化和代謝的主要場所。血漿谷草轉氨酶、丙氨酸氨基轉化酶和堿性磷酸酶等酶類活性能反映肝臟細胞受損情況及嚴重程度。谷草轉氨酶和丙氨酸氨基轉化酶主要位于肝細胞胞漿水溶性部分或線粒體中，活性增高常提示肝細胞破壞、細胞膜通透性增強或線粒體損傷。堿性磷酸酶是一種去磷酸化酶，與磷酸化的激酶作用相反，其可阻止核酸、蛋白等的磷酸化，進而影響DNA合成和細胞中信號轉導。一定范圍內的血清丙氨酸氨基轉化酶活性表示肝細胞代謝的活躍程度，該試驗中BC低劑量組丙氨酸氨基轉化酶活性顯著高于空白對照組，說明該劑量在一定程度上對肝臟功能產生不利影響，損傷機制尚需進一步研究；堿性磷酸酶主要來源肝臟和骨骼，因此檢測堿性磷酸酶的含量可以反映出肝臟和骨骼的狀態(tài)[14]。除此之外，堿性磷酸酶還能保護腸黏膜的完整性，抵御病原菌對腸道的損害[15]，各組之間谷草轉氨酶、堿性磷酸酶活性與總蛋白、白蛋白、尿素含量無顯著差異，且在正常范圍值之內，說明該試驗采用的凝結芽孢桿菌具有一定的可飼喂安全性。林麗花等[16]試驗證明，凝結芽孢桿菌顯著提高黃羽雞血清中堿性磷酸酶的活性?？偟鞍资菣z測機體營養(yǎng)狀況的重要指標[17]。肌酐是肌肉中磷酸肌酸的終末代謝產物，不能被重吸收，經腎小球過濾后排出體外。血漿肌酐的濃度變化反映腎小球的濾過能力。通過測定尿素，可以了解腎小球的濾過功能。它主要是經腎小球濾過，并隨尿液排出體外。當腎實質受損害時，腎小球濾過率降低，血液中血清尿素氮的濃度就會增加。該試驗中BC高劑量組肌酐含量極顯著高于空白對照組，丁金雪等[13]試驗表明空白對照組肉雞肌酐在27.82 mmol/L±2.46 mmol/L時，仍處于正常范圍內，因此該試驗各個試驗組肉雞肌酐處于正常范圍內。

凝結芽孢桿菌通過增強T淋巴細胞轉化，促進細胞因子分泌及免疫抗體產生，提高免疫器官指數來提高肉雞的免疫功能，其中以凝結芽孢桿菌2×108CFU/mL時提高機體免疫作用最顯著且效果優(yōu)于桿菌肽。