邱凱男，張 杰，宋婷婷

(北京農學院植物科學技術學院/農業(yè)應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206)

鈍葉酢漿草(Oxalisobtusa)屬于酢漿草科酢漿草屬，廣布于非洲納米比亞的納馬夸蘭區(qū)和克尼斯納區(qū)，生長在砂土或黏土中，株高10～35 cm，全株被有疏柔毛，莖短縮，葉基生，蓮座狀，掌狀復葉，3小葉，倒心形，小葉無柄，形狀大小略有不同?；▎紊?，顏色豐富，在不同的光照條件和溫度下有不同的花色，是秋季、冬季、早春不可多得的中小型花卉[1-2]。

鈍葉酢漿草具有獨特的葉形花色，可盆栽種植[3]，作為年宵花供應市場。盆栽可擺放于廣場、花壇、花臺或布置巖石園，鈍葉酢漿草是中國南方全部生育期可以在露地栽培的地被[4]，生長迅速，覆蓋力強[5]。如今，鈍葉酢漿草已經(jīng)走進各個園藝愛好者的視野并受到追捧[6]，目前只在網(wǎng)絡電商中出售種球和盆栽，鱗莖按照規(guī)格不同從2～50元不等，盆栽根據(jù)品種從15～100元不等，部分新品種能賣出數(shù)百元的價格。繁育困難，供不應求，是其市場價格走高的主要因素。

目前僅有少量酢漿草專類玩家培育部分種內雜交品種[7]，而對其相關研究少之又少。現(xiàn)今，對于酢漿草屬組織培養(yǎng)的研究大部分集中在紫葉酢漿草(Oxalistriangularis)上[7-15]，另有研究者研究熔巖酢漿草(Oxalisspiralissubsp.vulcanicola)的組培快繁技術[16]，還有部分研究者研究山酢漿草(Oxalisacetosella)的組織培養(yǎng)體系[17]；對于鈍葉酢漿草的研究僅僅停留在種群鑒別上。研究者發(fā)現(xiàn)不同產地的鈍葉酢漿草間存在生殖隔離[18-19]，解釋鈍葉酢漿草雜交苗培育的困難。而對于鈍葉酢漿草的組織培養(yǎng)仍沒有研究者涉足。

園藝師為了創(chuàng)造更多花色的品種，會對鈍葉酢漿草進行雜交，但鈍葉酢漿草為異形花柱[2]，不易結實，部分品種存在生殖隔離[19]，種子是頑拗性種子，不耐失水，雜交種子采收后要立即播種，發(fā)芽率低，發(fā)芽不整齊[2]，在中國部分播種苗無法形成鱗莖直接枯萎死亡。生產中鈍葉酢漿草通常使用鱗莖繁殖?？墒氢g葉酢漿草收獲的鱗莖尺寸不均，不便標準化生產，儲藏時易失水死亡。以上問題是鈍葉酢漿草批量生產和工廠化育苗的瓶頸。

為了建立鈍葉酢漿草通用性強，生長繁殖速度快的組織培養(yǎng)體系，該試驗以雜交鈍葉酢漿草的葉片和莖尖為外植體，在含有不同質量濃度激素的培養(yǎng)基上進行組培研究。旨在獲得鈍葉酢漿草的完整繁殖體系，提高其種苗質量，為鈍葉酢漿草的深入研究提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取購買于北京四環(huán)花木中心的鈍葉酢漿草‘鋰輝石’(Oxalisobtuse‘Kunzite’)、鈍葉酢漿草‘芬達’(Oxalisobtusa‘Fanta’)、鈍葉酢漿草‘大花’(Oxalisobtuse‘large form’)長勢相近、發(fā)育正常的植株莖尖和葉片為試驗材料。材料放置于北京農學院實驗樓組培室內培養(yǎng)，環(huán)境條件設置：光照14 h/d，光照強度2 000 lx，溫度25 ℃±2 ℃，濕度50%～55%左右。

1.2 材料處理

選擇盛花期、無病蟲害的鈍葉酢漿草植株的葉片和莖尖為繁殖材料。將選取的莖尖和葉片用2%表面活性劑溶液浸泡2 min，流水沖洗40～60 min，75%酒精處理15 s。將葉片分為3組，分別用2%NaClO溶液浸泡5、10和15 min，無菌水沖洗2次，葉片切成大小0.5 cm2左右，莖尖切成大小0.5 cm，備用。

1.3 啟動培養(yǎng)

試驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在萘乙酸(NAA)質量濃度保持不變的情況下，每增加0.5 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的質量濃度設置一組培養(yǎng)基，設置6個試驗組(表1)。將經(jīng)過消毒處理的葉片接種到6組培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種9片葉，設置5次重復。將經(jīng)過消毒處理的莖尖接種到6組培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種6段莖尖，設置5次重復。將完成接種的培養(yǎng)基放入組培室內暗培養(yǎng)，28 d后轉為光培養(yǎng)。每隔7 d觀察記錄外植體、愈傷組織的生長狀態(tài)及出愈率，選出最佳外植體、啟動培養(yǎng)基和消毒時間。

表1 不同質量濃度激素的鈍葉酢漿草初代培養(yǎng)基的配制Tab.1 Preparation of Oxalis obtusa primary medium with different hormone concentrations

1.4 繼代培養(yǎng)

試驗設置NAA質量濃度為0.1 mg/L和0.2 mg/L兩大組，每一大組內設置6-BA 1.0、1.5和2.0 mg/L 3組，共計6組(表2)。經(jīng)過初代培養(yǎng)的外植體長出芽后，將其分別接種到6組繼代培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)瓶接種5個芽，設置5次重復，在繼代培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每隔7 d觀察記錄芽的生長情況，選出最佳繼代培養(yǎng)基，待芽生長到一定規(guī)格后移入生根培養(yǎng)基中。

表2 不同質量濃度激素的鈍葉酢漿草繼代培養(yǎng)基的配制Tab.2 Preparation of Oxalis obtusa subculture medium with different concentrations of hormones

1.5 生根培養(yǎng)

試驗以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設置6-BA質量濃度為0 mg/L和0.5 mg/L兩大組，每一大組內設置NAA 0.05、0.10和0.15 mg/L，共計6組(表3)。將生長達到5 cm的芽移入6組生根培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿接種5個芽，設置5次重復，觀察植株變化情況，待根系生長至一定長度后進行煉苗。

表3 不同質量濃度激素的鈍葉酢漿草生根培養(yǎng)基的配制Tab.3 Preparation of root medium Oxalis obtusa with different concentrations of hormones

1.6 煉苗與移栽

組培苗根系長度達到5 cm以上，打開培養(yǎng)瓶進行煉苗。首先在溫室內半陰處輕輕旋松瓶蓋2 d，保證培養(yǎng)瓶內外的氣體交換，然后完全開蓋2 d，在自然光下開瓶煉苗3 d。最后將泥炭、珍珠巖和蛭石按照2∶1∶1比例混合作為基質，種植組培苗，并逐步轉入日常管理。

2 結果與分析

2.1 最適消毒時間的選擇

將3種鈍葉酢漿草的外植體暗培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計最適消毒時間，見表4和圖1及圖2。‘大花’鈍葉酢漿草葉片是3個品種中表現(xiàn)最好的，其余兩個品種存活率低不做統(tǒng)計。用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡10 min的消毒方法最好，外植體成活率高達74.0%，且長出大量愈傷組織，有利于后期植株生長。用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡15 min的消毒方法外植體無菌率最高，達80.0%，但成活的外植體沒有長出愈傷組織，且褐化、黃化嚴重，失去生命力，如圖1所示。而用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡5 min的消毒方法外植體損傷最小，但污染率最高，不利于后期無菌操作，如圖2所示。

表4 不同消毒方法對‘大花’鈍葉酢漿草外植體的影響Tab.4 Effects of different disinfection methods on explants of Oxalis obtuse ‘large form’

2.2 最適啟動培養(yǎng)基的選擇及最適外植體的選取

3種鈍葉酢漿草的外植體暗培養(yǎng)28 d后，轉入光培養(yǎng)7 d，并對生長情況進行統(tǒng)計。不同質量濃度激素配比導致各培養(yǎng)基外植體生長情況不同，其中‘大花’鈍葉酢漿草的表現(xiàn)最明顯，對其進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(表5)。A2到A5各組不同程度誘導出愈傷組織，其中A4組愈傷組織飽滿，呈松散狀，表面透明，有綠色的芽點出現(xiàn)，生長良好，利于分化，最為優(yōu)秀。A1組外植體萎縮，沒有分化出愈傷組織。A2組外植體褪色，愈傷組織排列緊密，半透明，呈白色，沒有芽點。A3組愈傷組織排列緊密，呈淺黃色，分化趨勢很慢。A5組愈傷組織淺綠色，沒有芽點，松散程度介于A3組、A4組之間。A6組外植體飽滿，但沒有分化出愈傷組織和芽點。6組莖尖全部成活，狀態(tài)飽滿，但污染嚴重。通過比較，A4組長勢最快，莖尖中心長出新葉，新葉葉柄伸長，葉片展開，生長良好，最為優(yōu)秀。A2組和A5組莖尖生長緩慢。A3組莖尖長出新葉，但新葉仍皺縮。A1組和A6組的莖尖沒有生長。通過比較，A4組的鈍葉酢漿草愈傷組織和莖尖生長最好，如圖3所示。A1組和A6組的莖尖沒有生長。采用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L瓊脂的配方為鈍葉酢漿草最適啟動培養(yǎng)基。培養(yǎng)時，莖尖的污染狀況較葉片更嚴重。鈍葉酢漿草莖尖不適宜作為外植體。而鈍葉酢漿草葉片消毒效果好，是啟動培養(yǎng)的最佳外植體。

表5 不同啟動培養(yǎng)基對‘大花’鈍葉酢漿草外植體的影響Tab.5 Effects of different primary medium on explants of Oxalis obtuse ‘large form’

2.3 不同品種在最適啟動培養(yǎng)基中的生長情況

暗培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計3種鈍葉酢漿草愈傷組織的分化情況。不同品種在同種激素配比下外植體出愈率不同(表6)。通過比較，葉片最厚質地最硬的‘大花’鈍葉酢漿草出愈率最高，在A4組中高達66.7%?！囕x石’鈍葉酢漿草葉片較厚，質地較軟，在A4組出愈率為51.8%，而葉片較薄質地最軟的‘芬達’鈍葉酢漿草出愈率較低，只有22.2%。3個品種的培養(yǎng)狀態(tài)如圖4所示。在激素配比相同時，鈍葉酢漿草葉片越厚、質地越硬，更易分化出愈傷組織，更適宜植物組織培養(yǎng)。

表6 3個品種鈍葉酢漿草在同種激素配比下外植體出愈率Tab.6 The germination rate of 3 varieties of Oxalis obtusa explants under the same hormone concentration

2.4 最適繼代培養(yǎng)基的選擇

在NAA為0.1 mg/L時，隨著6-BA質量濃度升高，鈍葉酢漿草芽的生長速度加快，分枝增加(表7)。其中，B3組芽生長速度最快，長出的分枝較多，同時芽高度適中，莖直立健壯，長勢最優(yōu)。B1組芽生長較快但分枝極少。B2組芽生長較快，芽分支少，莖直立。而當NAA為0.2 mg/L時，隨著6-BA質量濃度升高，鈍葉酢漿草芽的生長速度略微加快，但分枝形態(tài)彎曲無法利用。B4組芽生長很慢，分枝少，莖高而扭曲。B5組芽生長較慢，分枝少，莖彎曲。B6組生長較快，芽分枝較多，但形態(tài)扭曲難以分離。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L瓊脂，是培養(yǎng)鈍葉酢漿草的最適繼代培養(yǎng)基。

表7 不同繼代培養(yǎng)基對鈍葉酢漿草外植體的影響Tab.7 Effects of different subculture medium on explants of Oxalis obtusa

2.5 最適生根培養(yǎng)基的選擇

在6-BA質量濃度為0.0 mg/L時，隨著NAA質量濃度升高，鈍葉酢漿草根的生長速度加快(表8)。其中C2組根密而粗壯，葉綠色，植株健壯，長勢最好。C1組植株較弱，根密且細弱，葉淺綠。C3組植株較細弱，根稀而粗壯，葉淺綠。

在6-BA質量濃度為0.5 mg/L時，隨著NAA質量濃度升高，鈍葉酢漿草根的生長情況被明顯抑制，植株狀態(tài)差。其中C4組植株細弱，根系稀疏，葉黃。C5組植株很弱，只有零星根系長出，葉黃。C6組沒有分化出根系，葉黃。采用1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L瓊脂的培養(yǎng)基是鈍葉酢漿草的最適生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到的苗在煉苗時損失少，移栽容易恢復，葉片深綠且生長快，如圖5所示。

表8 不同生根培養(yǎng)基對鈍葉酢漿草無菌苗的影響Tab.8 Effects of different root medium on sterile seedlings of Oxalis obtuse

3 討 論

鈍葉酢漿草組織培養(yǎng)的外植體選擇很重要，一般選用葉片或莖尖，其中莖尖消毒不便、易污染[17]，而葉片消毒操作簡便，污染率低，因此鈍葉酢漿草組織培養(yǎng)的最適外植體是葉片。胡國富等[12]確定培養(yǎng)三角紫葉酢漿草的最適外植體為葉片。陳芬等[16]以熔巖酢漿草葉片為外植體研究得出組培快繁技術。該試驗使用葉片為外植體進行培養(yǎng)與前人研究結果一致。

該試驗確定鈍葉酢漿草葉片的最適消毒方法，75%酒精浸泡15 s后用2%NaClO溶液浸泡10 min的消毒效果最好，外植體成活率最高。消毒時間短，外植體不易損傷，但無法殺死雜菌，通常長出乳白色或淡黃色菌落。其中為了使葉片更清潔，用流水沖洗葉片時間應加長到40 min至60 min，沖洗時水流適中，防止葉片損傷。在選取的3個品種中，葉片的質地越硬出愈率越高。葉片最硬最厚的‘大花’葉片平整、絨毛少，能緊密貼合培養(yǎng)基，在各組培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高，長勢最好。葉片最薄、質地最軟的‘芬達’在各組培養(yǎng)基的出愈率都不理想。消毒時間長，薄葉片的品種易受傷害，受害葉片背面呈海綿狀，質地軟、易碎，操作困難，出愈率低，部分葉片褪色，培養(yǎng)時易黃化、褐化。而厚葉片的品種在消毒后受到的損傷小，便于劃傷培養(yǎng)。鈍葉酢漿草葉片厚、質地硬的品種更適宜植物組織培養(yǎng)。

不同質量濃度的激素配比導致外植體在啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過程中產生不同的生長情況。啟動培養(yǎng)中，NAA和6-BA對鈍葉酢漿草葉片愈傷組織的形成起到關鍵作用。高貴珍等[20]在紫葉酢漿草組織培養(yǎng)中確定啟動培養(yǎng)基激素配比為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，外植體接種10 d后即可產生愈傷組織，誘導率83.3%。而在該試驗當NAA質量濃度保持不變時，隨著6-BA的質量濃度漸漸升高，其對鈍葉酢漿草外植體分化趨勢越來越強。當6-BA的質量濃度超過臨界值2.0 mg/L時，6-BA質量濃度逐漸升高，鈍葉酢漿草莖愈傷組織排列緊密，不利出芽。當6-BA質量濃度2.5 mg/L，NAA質量濃度0.2 mg/L時，葉片不會長出愈傷組織，莖尖也不會生長。該試驗將啟動培養(yǎng)基激素配比調整為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。繼代培養(yǎng)中，NAA誘導鈍葉酢漿草植株長出不定根，6-BA促進莖葉伸長和誘導側芽生成。蔡麗瓊等[21]、張興桃[22]等在紫葉酢漿草組織培養(yǎng)中確定繼代培養(yǎng)基激素配比為NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，不定芽增殖系數(shù)最高，達3.46±0.61。而該試驗過程中，當NAA質量濃度0.1 mg/L時，鈍葉酢漿草再生芽生長速度隨著6-BA質量濃度增加而加快，形態(tài)直立健壯。當NAA質量濃度0.2 mg/L時，再生芽生長速度隨著6-BA質量濃度增加而加快，生長旺盛但形態(tài)發(fā)生不可逆轉的扭曲；可見只有二者處于合適的比例時，外植體才能快速大量產生愈傷組織，并加以誘導產生可用的再生芽，因此該試驗最佳繼代培養(yǎng)為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。生根培養(yǎng)中，王利[23]在紫葉酢漿草組織培養(yǎng)中確定生根培養(yǎng)基激素配比為NAA 0.2 mg/L時，叢生芽發(fā)生效果好，葉片寬大，葉柄粗壯，根系健壯，培養(yǎng)全過程只要40 d，成活率最高達96%。而該試驗培養(yǎng)基同時加入6-BA和NAA時，不論NAA為何種質量濃度鈍葉酢漿草無菌苗的生長狀況都不好。當培養(yǎng)基中只有NAA時，隨著NAA質量濃度的升高，植株根系生長加快，NAA質量濃度為0.1 mg/L時，出根率59.2%，得到的無菌苗根密而粗壯，便于移栽。當NAA質量濃度超過臨界值0.1 mg/L時，NAA質量濃度逐漸升高，鈍葉酢漿草根系數(shù)量減少，植株長勢變差，因此該試驗將激素NAA確定為0.1 mg/L。

為了提高移栽成活率，讓鈍葉酢漿草組培苗更好生長，需要先在溫室半陰處適應，同時因為鈍葉酢漿草有遇高溫休眠的習性，組培苗移栽后應盡量處于18～25 ℃的環(huán)境內，防止環(huán)境溫度過高引起組培苗落葉休眠死亡。由于組培瓶內濕度大，移栽后的組培苗地上部分仍然要保持一定濕度，組培苗定植后的根系尚未完全適應基質，所以應保持基質濕潤，防止基質過澇爛根。并隨日常管理逐漸降低濕度，直至與溫室內一致。此外需要注意的是，組培苗根部的培養(yǎng)基要清理干凈，否則會滋生大量細菌真菌引起根部腐爛。

該試驗以鈍葉酢漿草葉片為外植體，檢測葉片的消毒時間，篩選啟動培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，最終獲得大量鈍葉酢漿草組培苗，確立鈍葉酢漿草組織培養(yǎng)技術體系，為批量化生產提供基礎。