邢一帆，陳 麗，張 杰，宋婷婷

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京 102206)

生石花(Lithopskarasmontana)是番杏科生石花屬多年生的肉質(zhì)草本植物，體型小，像石頭半埋在地下，常見于巖床縫隙、石礫之中，盛夏至中秋開花，又名石頭花[1]。生石花形如彩石，色彩豐富，株型小巧，一般盆栽于室內(nèi)觀賞，作為一種形狀多樣的盆栽植物廣受大眾的喜愛，其觀賞價值高，同時可以起到凈化空氣的作用，符合大眾對于花卉的消費趨勢。生石花作為一種多肉植物，由于其獨有的特征，更是吸引越來越多人的喜愛，需求量逐漸上升導(dǎo)致其價格隨之上漲[1]。

生石花的繁殖靠種子或扦插[2]。由于扦插是由一個植株自然形成多個頭后，繁殖產(chǎn)生新植株，因此人們更側(cè)重于種子繁殖。一般采用室內(nèi)盆播，種子很容易發(fā)芽，但生石花的種子細小，從播種到成苗時間約2～3年，繁殖系數(shù)較低，難以滿足生產(chǎn)需要。為滿足市場的需求，快速大量繁殖生石花成為一個重要的問題[2]。

近年來，植物組織培養(yǎng)作為快速繁殖的方法在不同植物中被廣泛應(yīng)用，其不但可以縮短植物的生長周期，更為植物脫毒苗的培育提供可參考的方式。盡管部分多肉植物已經(jīng)能夠通過組織培養(yǎng)的方法快速繁殖，如白銀壽[3]、短葉巨象[4]、水晶掌[5]、白銀壽‘奇跡’[6]、玉露[7]，但有關(guān)生石花組織培養(yǎng)的報道還很少，只有種子的繁殖體系被建立，其葉肉組織培養(yǎng)體系尚未建立[8]。生石花與其他多肉植物的品種差異性較大，常規(guī)的培養(yǎng)基不能共用[3-7]。該研究以生石花的葉肉作為試驗材料，利用組織培養(yǎng)的方法，篩選適宜生石花外植體離體培養(yǎng)的消毒時間、激素質(zhì)量濃度等條件，建立生石花快繁體系，旨在獲得品質(zhì)優(yōu)良、生長快速的種苗，為后續(xù)生石花的品種培育和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生石花品種‘花紋玉’購買于北京花鄉(xiāng)花卉市場，以生石花的葉肉作為材料。培養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院科技綜合樓組培室，環(huán)境條件設(shè)置：光照強度2 000 lx，光照14 h/d，溫度(23±2) ℃，相對濕度55%[9]。

1.2 材料處理

外植體滅菌：選用大小相近的成熟生石花葉肉，清潔劑浸泡約15 min，自來水沖洗30 min備用。在超凈臺上用75%的乙醇沖洗，2%NaClO溶液浸泡，組合分別是5 s 75%的乙醇和8 min 2%NaClO溶液，5 s 75%的乙醇和12 min 2% NaClO溶液，30 s 75%的乙醇和8 min 2% NaClO溶液，30 s 75 %的乙醇和12 min 2% NaClO溶液；無菌水浸泡1～2 min，沖洗3～5遍。將消毒后的葉肉放置在無菌濾紙上，切成1～1.5 cm段作為外植體，接種到啟動培養(yǎng)基上。

1.3 試驗步驟

1.3.1 培養(yǎng)基種類和配方 啟動培養(yǎng)基4種：培養(yǎng)基A1、培養(yǎng)基A2、培養(yǎng)基A3、對照培養(yǎng)基。培養(yǎng)基A1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L；培養(yǎng)基A2：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L；培養(yǎng)基A3：MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L；對照培養(yǎng)基：MS(不添加任何生長調(diào)節(jié)劑)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基3種：培養(yǎng)基B1、培養(yǎng)基B2、對照培養(yǎng)基。培養(yǎng)基B1：MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 2.0 mg/L；培養(yǎng)基B2：MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 4.0 mg/L；對照培養(yǎng)基：MS(不添加任何生長調(diào)節(jié)劑)。

生根培養(yǎng)基4種：培養(yǎng)基C1、培養(yǎng)基C2、培養(yǎng)基C3、培養(yǎng)基C4。生根培養(yǎng)基配方為1/2MS基本培養(yǎng)基，瓊脂粉7 g/L，蔗糖20 g/L，pH調(diào)至6.0。培養(yǎng)基C1：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.00 mg/L；培養(yǎng)基C2：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L；培養(yǎng)基C3：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L；培養(yǎng)基C4：1/2MS+6-BA 0 mg/L+NAA 0.10 mg/L。

1.3.2 啟動培養(yǎng) 將試驗材料放置于啟動培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0，蔗糖30.0 g/L，瓊脂7.0 g/L。每瓶培養(yǎng)基接種4個外植體，共計4個處理，每個處理5個重復(fù)。接種30 d后觀察組培瓶內(nèi)外植體的生長狀態(tài)，待其生長成熟后備用。

1.3.3 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將膨大的外植體切割為長約1.0 cm的段，隨后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每瓶培養(yǎng)基接種4個外植體，共計3個處理，每個處理5個重復(fù)。接種30 d后觀察組培瓶內(nèi)外植體的生長狀態(tài)及愈傷組織的生長情況，篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

為檢測生石花芽的分化率，將生長狀態(tài)較好的愈傷組織分別接種在適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種5塊愈傷組織，設(shè)置5個重復(fù)，30 d后觀察并統(tǒng)計結(jié)果。

1.3.4 生根培養(yǎng) 待植株長至2 cm以上時，通過無菌操作將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。每瓶接種叢生芽3個，每處理5個重復(fù)，光照時間延長為16 h/d，30 d后統(tǒng)計生根率及生根條數(shù)，選擇最適的生根培養(yǎng)基。

1.3.5 煉苗與移栽 待植物組織的根系健壯，能夠達到移栽的狀態(tài)后進行煉苗處理。煉苗的具體步驟：在無菌室內(nèi)先松蓋1～2 d讓其適應(yīng)外界環(huán)境，部分開蓋，直至完全揭蓋；然后移到室外進行自然光照7～10 d，遮陰約為60%，煉苗完成后將組培苗進行移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌率及成活率

生石花外植體進行消毒處理試驗，設(shè)置75%的乙醇和2%的NaClO溶液的4種不同時間梯度，經(jīng)過30 d培養(yǎng)，5 s 75%酒精和8 min 2% NaClO溶液的處理最合適，外植體愈傷組織膨大，有分化趨勢，并且無菌率高達41.2%，成活率高達45.6%(表1)。雖然將2%的NaClO溶液的消毒時間延長至12 min后，愈傷組織生長旺盛，卻產(chǎn)生乳白色污染(圖1)。另外，盡管30 s 75%的乙醇和8 min NaClO溶液的處理無菌率和成活率較高，但是愈傷組織小、緊皺，沒有分化趨勢，不適合后期的植株生長。

表1 不同消毒時間對生石花愈傷組織的影響Tab.1 Effects of different disinfection methods on Lithops karasmontana callus

注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

2.2 啟動培養(yǎng)

將外植體接種到啟動培養(yǎng)基上，其中培養(yǎng)基A1為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，愈傷組織狀態(tài)較好，生芽率高，分化效果良好；出芽率高達65.2%。培養(yǎng)基A3的出芽率31.4%，但是愈傷組織狀態(tài)不好，呈現(xiàn)出黃綠色，僅有少量芽點出現(xiàn)，分化一般；培養(yǎng)基A2和對照培養(yǎng)基的出芽率不足10%。培養(yǎng)基A1確定為最佳啟動培養(yǎng)基，見表2。

表2 不同激素組合對生石花愈傷誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different combinations of hormones on callus induction of Lithops karasmontana

注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

外植體由于經(jīng)過啟動培養(yǎng)后膨大，需將其切割成1.0 cm左右，再接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進行篩選。其中培養(yǎng)基B1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，愈傷組織誘導(dǎo)率高達65.7%，叢芽分化率高達75.2%，培養(yǎng)基B1確定為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，見表3。培養(yǎng)基B2愈傷組織誘導(dǎo)率高達53.5%，叢芽分化率高達58.4%，僅次于培養(yǎng)基B1對外植體的影響，同時說明激素質(zhì)量濃度越高，對植物的生長不是越好[5,10]；由于培養(yǎng)基B3沒有加入激素，愈傷誘導(dǎo)率和分化率均為0，不具有影響能力，結(jié)果如圖1所示。

2.4 生根培養(yǎng)

為了確定生石花的最適光照時間，將即將生根的植株放置于8 h和16 h的光照條件下，30 d后，植株在16 h的時間范圍中，無論植株形態(tài)或根生長情況都符合正常觀賞要求，且顏色美艷(圖2)。而8 h光照條件下的植株由于光照不夠，長勢奇怪，不符

表3 不同激素質(zhì)量濃度對生石花愈傷增殖和分化的影響Tab.3 Effects of different hormone concentrations on callus proliferation and differentiation of Lithops karasmontana

注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

培養(yǎng)基6-BA/(mg/L )NAA/(mg/L)平均根數(shù)生根率/%C11.01.000.00.0C20.50.109.951.4 aC30.10.016.318.5bC40.00.105.68.3 c

注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

合生石花的觀賞特征，所以，試驗最終將最佳光照時間設(shè)定為16 h(圖3)。

待生石花植株長至2 cm以上時，在無菌條件下取出健壯植株，接種到生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。其中培養(yǎng)基C2：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均根數(shù)最多為9.9，生根率最高，達到了51.4%，培養(yǎng)基C2確定為最佳生根培養(yǎng)基，見表4。

3 討 論

該試驗以生石花葉肉作為外植體，通過設(shè)置不同消毒時間處理，篩選出5 s 75%乙醇和8 min 2% NaClO溶液為最適消毒方式，但是為了進一步提高外植體的無菌率和成活率，消毒時間仍需要繼續(xù)優(yōu)化改良。30 s 75%的乙醇和8 min 2%的NaClO溶液的消毒時間使得材料愈傷組織小，愈傷組織上多白色透明細小珠點，材料的愈傷組織明顯減少，并且緊實。當外植體接種到啟動培養(yǎng)基中，經(jīng)過30 d培養(yǎng)后，觀察外植體變化情況。培養(yǎng)基A1、培養(yǎng)基A2、培養(yǎng)基A3的外植體呈現(xiàn)膨大和愈傷化現(xiàn)象，對照培養(yǎng)基外植體萎縮，無分化。對4種試驗處理后的外植體狀態(tài)進行比較，只有當培養(yǎng)基中6-BA 2.0 mg/L時，生石花葉肉切面分化出具有增殖能力的黃綠色愈傷組織，能夠在后續(xù)過程中繼續(xù)誘導(dǎo)和分化[11-12]。培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L時，出芽率高達65.2%。激素對植物組織分化的形成具有重要作用，選擇合適的激素質(zhì)量濃度對植物組織培養(yǎng)十分重要[13]。由于多肉植物的快繁體系多以1/2MS作為基本培養(yǎng)基[14]，該試驗采取相同的方法，培養(yǎng)效果良好。與此同時，在1/2MS培養(yǎng)基中加入適量NAA能夠有效誘導(dǎo)植物生根[4,8,15]，生根率可達51.4%。根系質(zhì)量良好，明顯高于未添加NAA的對照培養(yǎng)基。生根后的植物材料移栽成功率高達90%，生長良好。

由于生石花原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，其在引種之前接受的光照時間和光照強度顯著高于培養(yǎng)條件。高強度的光照使其具有顏色鮮艷，莖部粗壯等特點，而缺乏光照會對其生理狀態(tài)造成至關(guān)重要的影響[1,16]。8 h條件下，植株出現(xiàn)畸形等癥狀，不適合觀賞；而16 h的光照條件下，植株形態(tài)優(yōu)美，且顏色美艷。該試驗最終將最佳光照時間設(shè)定為16 h，與前人的研究結(jié)果一致[1,17]。

該試驗以生石花的葉肉為試驗材料，對消毒時間和質(zhì)量濃度進行篩選，確定最適宜的培養(yǎng)基條件，建立組培快繁體系。該體系能夠快速、高效繁殖生石花組培苗植株，縮短育種周期，提高外植體的生根率。提高生石花生長速度，彌補了繁殖效率低等缺陷，獲得完整的生石花組織快繁體系，提高種苗質(zhì)量，可用于生石花的大量生產(chǎn)繁殖，是一種通用性強，建立繁殖速度快的生石花組織培養(yǎng)體系，為今后生石花組培苗生產(chǎn)提供參考。