張廣樂(lè)，吉 麗，王昌全，李成偉，保志鵬，苗永旺*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201；2. 云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650212；3. 云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650224)

前腦鋅指蛋白(Forebrain embryonic zinc finger-like protein，F(xiàn)EZL)是鋅指蛋白超基因家族中的成員之一。鋅指結(jié)構(gòu)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)模體[1]。FEZL是包含6個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白和一個(gè)甘氨酸重復(fù)區(qū)域[2]。C2H2型是典型鋅指，具有以下同源保守序列：-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Lue-X2-His-X2-6-His (X為可變氨基酸)[3]。每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)是約30個(gè)氨基酸的微區(qū)，在Zn2+存在時(shí)折疊成ββα基序[4]。鋅指的串聯(lián)重復(fù)序列通常用于DNA或RNA識(shí)別，并且DNA識(shí)別由每個(gè)手指的α螺旋介導(dǎo)[4-5]。FEZL參與神經(jīng)元發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，已證實(shí)神經(jīng)元發(fā)育與機(jī)體免疫之間通過(guò)下游細(xì)胞因子的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)[6]。

FEZL基因位于普通牛第22號(hào)染色體上，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，編碼序列 (coding sequence，CDS)全長(zhǎng)為1 380 bp，6個(gè)外顯子的大小分別為27 bp、134 bp、907 bp、135 bp、133 bp和680 bp(登錄號(hào)：NM_001038198)。在普通牛中發(fā)現(xiàn)FEZL基因與乳腺炎相關(guān)聯(lián)。普通奶牛乳腺炎的易感性是由于信號(hào)肽5A (semaphorin 5A, SEMA5A) 基因的轉(zhuǎn)錄活性較低而導(dǎo)致的免疫反應(yīng)受損所致[7]。乳腺炎誘導(dǎo)了FEZL基因在乳腺中表達(dá)，并通過(guò)FEZL誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了SEMA5A的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)了與機(jī)體免疫相關(guān)的TNF-α和IL-8的表達(dá)[8]。FEZL也能誘導(dǎo)SEMA5A在易感牛中表達(dá)，但表達(dá)水平低于乳腺炎抗性牛[7]。在普通奶牛中發(fā)現(xiàn)FEZL基因編碼產(chǎn)物的多個(gè)甘氨酸殘基重復(fù)區(qū)長(zhǎng)度存在12G和13G兩種類型，13G/13G 型的FEZL降低了SEMA5A的表達(dá)水平，導(dǎo)致該型奶牛對(duì)乳腺炎易感，發(fā)病率是12G/12G 型奶牛的2倍[9]。目前對(duì)水牛、羊等家養(yǎng)動(dòng)物的FEZL基因研究報(bào)道較少。

近年由于高檔乳制品的市場(chǎng)拉動(dòng)，水牛乳業(yè)得到了迅猛發(fā)展，水牛奶已經(jīng)成為世界上第二大牛奶供應(yīng)來(lái)源。相比于荷斯坦牛奶，水牛奶含有更高的乳脂、乳糖、乳蛋白和礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的乳品加工特性[10]。迄今，有關(guān)乳腺炎抗性在水牛的研究較少，因此，開展水牛乳腺炎抗性的分子遺傳基礎(chǔ)研究十分必要。檳榔江水牛(Binglangjiang buffalo, BLJ buffalo)主要分布在云南西部檳榔江流域，其耐粗飼，抗病性強(qiáng)，泌乳性能好，牛奶品質(zhì)佳，是中國(guó)水牛奶業(yè)發(fā)展的重要遺傳資源[11-13]。本研究分離鑒定了檳榔江水牛FEZL基因的編碼區(qū)，并且通過(guò)對(duì)其序列的功能生物信息學(xué)分析以及采用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了基因多組織差異表達(dá)分析，以揭示水牛FEZL基因的功能，為闡明水牛乳腺炎抗性的分子遺傳基礎(chǔ)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在云南省騰沖市采集4頭成年健康的泌乳期檳榔江水牛組織樣品，每頭牛分別取心、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腦、垂體、乳腺、瘤胃、小腸、十二指腸等組織。采樣水牛飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，年齡、胎次相近，無(wú)直接血緣關(guān)系。

1.2 組織總RNA提取與cDNA的合成

使用RNA抽提試劑盒(RNAiso Plus, Takara,中國(guó)大連)分離組織總RNA，用RNase-free水將產(chǎn)物溶解后檢測(cè)濃度和完整性。再使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen M-MLV, Takara,中國(guó)大連)合成cDNA，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增及測(cè)序

以普通牛FEZL基因mRNA序列(登錄號(hào)為NM_001038198)為模板，使用Primer premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，用于分離水牛FEZL基因編碼區(qū)序列。

表1 水牛FEZL基因引物信息Table 1 Primer information of buffalo FEZL gene

PCR反應(yīng)體系包含上、下游引物各0.6 μL (10 μmol/L)，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，10×buffer(Mg2+)4 μL，dNTPs 2.0 μL(2.5 mmol/L)，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)經(jīng)94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性45 s， 52.6 ℃退火40 s， 72 ℃延伸1.5 min 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再72 ℃后延伸10 min，終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)效果經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序所用引物與PCR引物相同。

1.4 半定量RT-PCR檢測(cè)

以普通牛FEZL基因mRNA序列(GenBank登錄號(hào)為NM_001038198)為模板，同時(shí)以持家基因ACTB(GenBank登錄號(hào)為NM_001290932)為內(nèi)參，設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

半定量PCR反應(yīng)體系包含上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，mix 5 μL(康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，cDNA模板(50 ng/μL) 1 μL，ddH2O加至10 μL。PCR反應(yīng)首先94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性30 s， 65.2 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再后延伸72 ℃5 min，終止反應(yīng)。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的完整性，電泳膠圖采用Quantity One軟件對(duì)分析，獲得表達(dá)量數(shù)據(jù)。

采用Lasergene軟件包(DNAstar Inc.)對(duì)序列進(jìn)行核對(duì)與編輯，得到FEZL基因完整編碼區(qū)拼接序列，經(jīng)ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.gov/gorf/)確定開放閱讀框(open reading frame，ORF)，相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)、疏水性、跨膜區(qū)和信號(hào)肽等理化特征通過(guò)在線軟件Compute pI/Mw tool、ProtParam tool、ProtScale、TMHMM server 2.0和SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)分析；采用ProtComp 9.0軟件進(jìn)行FEZL的亞細(xì)胞定位；利用SOPMA程序?qū)ζ涞鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；基于同源建模法利用在線服務(wù)器SWISS-MODEL預(yù)測(cè)FEZL蛋白的空間三維結(jié)構(gòu)；通過(guò)半定量PCR技術(shù)以及Quantity One軟件對(duì)多組織表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)；最后采用Mega 4.0軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與基因分離鑒定

采用RT-PCR法對(duì)FEZL基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相同，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 水牛FEZL基因的RT-PCR結(jié)果M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1. PCR產(chǎn)物Fig. 1 RT-PCR products of buffalo FEZL geneM. Marker-DL2000；1. product of PCR

PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到1 593 bp的序列；通過(guò)與已發(fā)表的?？莆锓N序列比較，確定所得序列為水牛FEZL基因序列。檳榔江水牛完整的CDS為1 380 bp，編碼459個(gè)氨基酸，其氨基乙酸鏈的長(zhǎng)度均為13G型(圖2)。將獲得的水牛FEZL基因CDS區(qū)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列號(hào)：MK433000。FEZL基因CDS序列由21.30%A、28.26%G、16.45%T和33.99%C堿基組成。G+C含量為62.25%。水牛FEZL基因及其編碼的氨基酸序列見圖2。

圖2 檳榔江水牛FEZL基因的CDS全序列及其所編碼的氨基酸序列.FEZL多肽氨基乙酸鏈；.保守結(jié)構(gòu)域：COG5048(289-440AA)；___. 起始密碼子；*.終止密碼子Fig.2 Complete CDS of BLJ buffalo FEZL gene and its encoded amino acid sequence. FEZL glycine chain sequence；. A conservative domainCOG5048 (289-440AA)；___. the start codon;*. the stop codon

2.2 基本理化特征

檳榔江水牛FEZL的基本理化特征與普通牛FEZL(13G型、12G型登錄號(hào)分別為AY644770，NM_001038198)比較結(jié)果見表2。疏水性分析表明水牛FEZL親水性平均值(GRAVY)為-0.324，表明水牛FEZL屬于親水性的蛋白質(zhì)(圖3)。

表2 檳榔江水牛與普通牛FEZL的基本理化特征Table 2 Basic physicochemical characteristics of FEZL for BLJ buffalo and cattle

圖3 檳榔江水牛FEZL疏水性分析分值>0代表疏水性；分值<0代表親水性Fig. 3 Hydropathy analysis of BLJ buffalo FEZLscore>0 means hydrophobic; score<0 means hydrophilic

2.3 水牛FEZL蛋白的結(jié)構(gòu)特征

檳榔江水牛FEZL蛋白的保守結(jié)構(gòu)域見圖4。預(yù)測(cè)檳榔江水牛FEZL蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，但含有1個(gè)COG5048保守結(jié)構(gòu)域(289～440 AA)，為鋅指結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位分析表明，F(xiàn)EZL定位于細(xì)胞核內(nèi)(支持率為100%)，為在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能作用的蛋白質(zhì)。

圖4 檳榔江水牛FEZL蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig. 4 Predicted conserved domain of BLJ buffalo FEZL

預(yù)測(cè)顯示，水牛FEZL中62.9%的AA構(gòu)成無(wú)規(guī)卷曲、13.4%的AA構(gòu)成α螺旋、15.1%的AA構(gòu)成伸展鏈，8.6%的AA構(gòu)成β轉(zhuǎn)折。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，檳榔江水牛FEZL與鼠鋅指蛋白568模板(5wjq.1.C)一致性為42%。該蛋白含有典型的鋅指結(jié)構(gòu)，范圍在274～446 AA之間，與前面結(jié)構(gòu)域分析基本一致。從FEZL的三維結(jié)構(gòu)來(lái)看，水牛與普通牛的13G和12G型都有差異，但與普通牛13G型差異相對(duì)較小(圖5)。

圖5 預(yù)測(cè)的水牛FEZL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)a、b、c分別是預(yù)測(cè)的檳榔江水牛、普通牛13G型和12G型FEZL蛋白的3-D結(jié)構(gòu)Fig. 5 Predicted tertiary structure of buffalo FEZL proteina,b and c are the predicted 3-D structures of the FEZLin BLJ buffalo, cattle 13G and 12G, respectively

2.4 序列一致性與系統(tǒng)樹分析

水牛FEZL氨基酸序列與13G型普通牛的一致性為99.6%；與12G型普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicus)和山羊(Caprahircus)的一致性為99.3%；與綿羊(Ovisaries)和白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的一致性為99.1%；與馬(Equusasinus)和澳洲野狗(Canislupusdingo)的一致性為97.8%；與人(Homosapiens)的一致性為97.4%(圖6)?；跈壚平EZL氨基酸及其同源序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，水牛與普通牛、瘤牛和山羊、綿羊等聚在一大支上，支持率為99%；而人、馬和澳洲野狗聚在另一支上。

圖7 基于檳榔江水牛和其他物種的FEZL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on FEZL aminoacid sequences of BLJ buffalo and other species

2.5 組織差異表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR方法，檢測(cè)成年泌乳期水牛FEZL基因在12個(gè)器官組織中的差異表達(dá)。FEZL基因在水牛大腦中表達(dá)量最高，在心、脾、肺、腎、小腦、垂體組織中表達(dá)水平次之，在乳腺、小腸、肌肉、十二指腸中有少量表達(dá)，在瘤胃中有微量表達(dá)(圖8)。

圖8 泌乳期檳榔江水牛FEZL基因的多組織表達(dá)譜ACTB基因表達(dá)作為內(nèi)參;M. DL2000 DNA marker;1. 心臟;2. 脾臟;3. 肺;4. 腎;5. 小腦;6. 大腦;7. 垂體;8. 肌肉;9. 乳腺;10. 瘤胃;11. 十二指腸;12. 小腸Fig.8 Multi-tissue expression profile of FEZL gene inlactating BLJ buffaloThe ACTB expression served as an internal control.M. DL2000 DNA marker;1. heart;2. spleen;3. lung;4. kidney;5. cerebellum;6. the brain;7. pituitary;8. muscle;9. breast;10. rumen;11. duodenum;12. small intestine

3 討 論

作為鋅指蛋白家族中的重要的成員，F(xiàn)EZL在動(dòng)物體神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZL基因與普通奶牛的乳腺炎有著密切的關(guān)聯(lián)[6]，但關(guān)于FEZL基因在水牛的研究上報(bào)道較少。為了闡明該基因在水牛中的功能，基于普通牛FEZL基因的序列，本研究分離鑒定了檳榔江水牛FEZL基因的CDS序列。通過(guò)序列測(cè)定和序列比對(duì)分析，確定所得到的序列就是水牛FEZL基因完整的CDS序列，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)了其理化特性與結(jié)構(gòu)特征。在FEZL基本的理化特性和結(jié)構(gòu)上，水牛與普通牛較為相似。序列一致性與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，水牛FEZL氨基酸序列與哺乳類動(dòng)物特別是?？莆锓N的FEZL序列一致性較高，在系統(tǒng)樹上聚在一起。以上揭示水牛FEZL在功能上與?？莆锓N的FEZL較一致。通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征分析，發(fā)現(xiàn)檳榔江水牛FEZL蛋白含有一個(gè)COG5048保守結(jié)構(gòu)域，為含有6個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是典型的細(xì)胞核內(nèi)反式作用因子與靶基因調(diào)控序列的結(jié)合域。近年研究表明，F(xiàn)EZL是一種在神經(jīng)元發(fā)育中起作用的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報(bào)道FEZL缺陷小鼠顯示出過(guò)度活躍的行為，表明FEZL在神經(jīng)元發(fā)育中起作用[6]。由此推斷，檳榔江水牛的FEZL也是作為細(xì)胞核內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與了有關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程。

在普通奶牛中已揭示乳腺炎能夠誘發(fā)乳腺中FEZL基因的表達(dá)，F(xiàn)EZL基因編碼產(chǎn)物能夠促進(jìn)細(xì)胞中SEMA5A的表達(dá)，SEMA5A表達(dá)量提高可以引起與機(jī)體免疫反應(yīng)相關(guān)的TNF-α和IL-8等多個(gè)基因的表達(dá)[8]。研究表明，在普通奶牛FEZL基因編碼產(chǎn)物存在一個(gè)GGC(甘氨酸)的插入突變導(dǎo)致FEZL的氨基乙酸重復(fù)區(qū)長(zhǎng)由12G變成13G, 12G/12G型奶牛SEMA5A的表達(dá)水平高，導(dǎo)致多個(gè)與機(jī)體免疫相關(guān)的基因的表達(dá)上升，使該型奶牛對(duì)乳腺炎表現(xiàn)為抗性，而13G/13G類型奶牛則相反，SEMA5A 的表達(dá)水平下降，表現(xiàn)對(duì)乳腺炎易感[9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)的表達(dá)量的增加對(duì)奶牛乳腺炎的易感性也有增強(qiáng)作用，13G型FEZL基因比12G型FEZL基因更能增加IGF1R的表達(dá)量[14]。河流型水牛乳腺炎只有4%左右的發(fā)病率[15-17]，而沼澤型水牛未見有患乳腺炎的報(bào)道。本文檢測(cè)的檳榔江水牛都未感染乳腺炎，本研究及之前檢測(cè)結(jié)果[7]顯示，水牛的FEZL均為13G/13G類型，提示水牛FEZL通過(guò)SEMA5A信號(hào)通路所起的免疫調(diào)控作用可能與普通牛有所差異。且在理化特性上，水牛的FEZL與普通牛的FEZL(13G型、12G型)存在一定的差異，主要表現(xiàn)在其疏水性氨基酸與極性氨基酸的組成、不穩(wěn)定系數(shù)及親水性等方面；在三級(jí)結(jié)構(gòu)上，水牛FEZL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與普通牛FEZL的兩種類型也存在一定差異。這些揭示作為轉(zhuǎn)錄因子的FEZL對(duì)靶基因的調(diào)控，水牛與普通牛存在差異，但這是否與水牛不易患乳腺炎有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)多組織差異表達(dá)分析，檢測(cè)到FEZL基因在所檢測(cè)的泌乳期水牛12個(gè)組織中都有表達(dá)，其中在大腦中的表達(dá)量最高，在瘤胃中的表達(dá)量最低。這揭示FEZL基因作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在水牛的多個(gè)組織中均發(fā)揮作用。該基因在水牛大腦中的表達(dá)量最高，揭示該基因與神經(jīng)功能相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，F(xiàn)EZL是基底前腦中單胺能(多巴胺能和5-羥色胺能)神經(jīng)元發(fā)育所必需的[18]。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在FEZL缺陷小鼠中，深層皮質(zhì)層中神經(jīng)元的發(fā)育或多或少是異常的，用小干擾RNA(siRNAs)敲除FEZL會(huì)改變V層錐體神經(jīng)元的樹突形態(tài)。本研究檢測(cè)到FEZL在水牛乳腺中有少量表達(dá)，這揭示FEZL基因參與了水牛的泌乳過(guò)程，至于該基因參與水牛的泌乳過(guò)程的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究揭示了水牛FEZL的理化特性及結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)FEZL基因在檢測(cè)的所有水牛組織中都有表達(dá)，其中在大腦中的表達(dá)量最高。初步確定水牛FEZL基因可能在水牛中作為一類核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程。確定水牛中FEZL氨基乙酸鏈的長(zhǎng)度均為13G/13G型，鑒于水牛不易感乳腺炎的特性，提示水牛FEZL參與相關(guān)基因的調(diào)控過(guò)程可能與普通牛中有差異。