北京建生藥業(yè)有限公司（100039）李宏強 朱慧 李玉珍

《中醫(yī)藥法》從2017年7月1日實施后，為我國中醫(yī)藥的健康發(fā)展提供了保障和基礎(chǔ)。然而，中藥的質(zhì)量控制問題一直未能得到很好的解決[1]。中成藥是將藥材本身進行提取或是碾碎成粉后做成制劑，由于藥物本身的成分組成多樣，現(xiàn)在一般是以其中某一成分作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，這就存在一定的弊端：①缺少量化指標(biāo)，多采用定性為主的標(biāo)準(zhǔn)。②偏重于單一成分的分析，往往只是對藥品當(dāng)中某一成分進行檢測。③測定品種不全面，僅僅只是對其中有效成分的含量進行了測評，對于中藥藥材當(dāng)中所含有的其他物質(zhì)卻不進行檢測[2]。按照中醫(yī)的觀點，只控制少量的指標(biāo)性成分難以確保中藥的功效。中醫(yī)辨證施治用的是藥味而非某個化學(xué)成分。人參皂苷與人參、甘草酸與甘草、麻黃素與麻黃在中醫(yī)看來是兩回事。中藥的“補氣”、“活血”、“滋陰”、“健脾”等功效，是藥材飲片或成藥方劑整體作用的結(jié)果。所以要確保中藥的功效，必須對方劑的物質(zhì)群整體予以控制。在尚不清楚中藥全體化學(xué)成分的情況下，用現(xiàn)代色譜、光譜、波譜、質(zhì)譜等儀器分析所得的指紋圖譜，實現(xiàn)對物質(zhì)群整體控制的思想應(yīng)運而生[3]。目前已經(jīng)有大量的研究，顯示了將圖譜技術(shù)用于中藥質(zhì)量控制的可行性[4]。

1 中藥中的多糖和蛋白

1.1 多糖 多糖是一類天然高分子化合物，由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成，又稱多聚糖。多糖的結(jié)構(gòu)可以分為一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。其相對分子質(zhì)量可達數(shù)萬甚至數(shù)百萬，是一類重要的生物信息大分子[5]。多糖具有多種生物學(xué)功能，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，與維持生物機能密切相關(guān)。多糖作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，主要是影響巨噬細胞、白細胞和淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能[6]。

同時多糖還在R NA，DNA和蛋白質(zhì)合成，cAMP和cGMP含量的調(diào)節(jié)，抗體以及干擾素的誘生等方面發(fā)揮作用。多糖廣泛存在于植物、微生物和動物等有機體中[7]。具有藥理活性多糖的含量被認為是天然產(chǎn)物藥用價值的指標(biāo)之一[8]。加之毒副作用小、不易造成殘留等優(yōu)點，其結(jié)構(gòu)及功能的研究已成為繼蛋白質(zhì)、核酸研究之后探索生命奧秘的又一重要領(lǐng)域[9]。

中藥多糖則是指從動、植物體內(nèi)和微生物中分離的活性多糖成分的總稱，目前已有近百種被分離提取鑒定出來，中藥中代表性的多糖有香菇多糖、枸杞多糖、黃芪多糖、人參多糖等。

香菇多糖來源于從香菇子實體。1969年首次有文章證實香菇多糖有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的作用，1985年作為抗癌新藥在日本上市，1988年我國開始進口用于惡性腫瘤的輔助治療。研究表明香菇多糖對多種癌癥有良好的療效，能夠延長患者的存活時間，此外，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)香菇多糖具有抗病毒和抗感染的功能[10]。

枸杞是我國第一批被列為藥食兼用的物品。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分，為多聚糖與多肽或蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物，是枸杞子中的主要活性組分。研究表明，LBP的活性成分不僅具有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老的作用，而且有降血脂、抗脂肪肝、降血糖、保肝潤肺、滋腎明目、強筋骨等作用。除此之外，老年人的易疲勞、食欲不振以及視力模糊的癥狀亦可得到改善[11]。

黃芪對人體的免疫能力具有重要的作用，既可影響特異性免疫，亦可影響非特異性免疫；既可影響免疫細胞自身代謝，亦可影響其功能。研究表明，黃芪多糖是黃芪免疫增強作用的主要藥效成分，尤其在增強黏膜免疫方面具有獨特作用[12]。目前，黃芪多糖是中藥多糖中研究最為活躍的產(chǎn)品之一，并已獲得廣泛的市場應(yīng)用。其代表性制劑注射用黃芪多糖主要用于提高機體免疫力，輔助治療癌癥、糖尿病等疾病，藥效明顯，有著非常廣闊的應(yīng)用前景[13]。

高相對分子質(zhì)量是多糖高級結(jié)構(gòu)的前提，多糖的許多藥理作用與其高相對分子質(zhì)量密切相關(guān)。如從灰樹花、松杉靈芝中獲得的相對分子質(zhì)量分別為800×103，10×103的多糖具有很強的抗腫瘤活性[14]。武漢大學(xué)用超聲波降解的方法降低香菇多糖相對分子質(zhì)量，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量小的多糖活性差，這可能同多糖分子形成的高級構(gòu)型有關(guān)[15]。因此，對于多糖類產(chǎn)品，分子量是研究其構(gòu)效關(guān)系，結(jié)構(gòu)特征等的基礎(chǔ)，更是考察其質(zhì)量是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)之一[16]。

1.2 蛋白和多肽 蛋白質(zhì)是由α-氨基酸按一定順序結(jié)合形成一條多肽鏈，再由一條或一條以上的多肽鏈按照其特定方式結(jié)合而成的高分子化合物。多肽是一類具有蛋白質(zhì)特性、分子量比蛋白質(zhì)小、由2～16個氨基酸通過肽鍵連接的化合物。蛋白多肽屬于大分子物質(zhì)。

動物藥是我國傳統(tǒng)中藥的重要組成部分。在我國最早的本草典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中，動物藥品種就收載了65種[17]。動物藥素有“血肉有情之品”[18]和“行走通竄之物”[19]之說，在活血化瘀、攻堅破積、祛風(fēng)止癢、搜風(fēng)通絡(luò)、壯陽益腎和消癥散結(jié)等方面，有著植物藥、礦物藥難以企及的活性和療效，已成為中醫(yī)藥防治疾病不可或缺的重要藥物資源。多肽、蛋白質(zhì)是動物藥中普遍存在的主要成分，是中藥中除了生物堿、多糖、皂苷等成分外的另一種重要的天然活性成分，在中藥發(fā)揮藥理藥效過程中扮演著重要角色[20]。

迄今為止，來源于動物的一些具有重要藥理活性的蛋白已應(yīng)用于臨床[21]。比如，蚯蚓在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中稱為地龍，在我國入藥已有四千余年的歷史，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿之功效，是一種常用動物藥材[22]。臨床文獻資料顯示：采用生化方法提取的新鮮地龍液有即刻平喘作用，起效快。上海中醫(yī)藥大學(xué)的馮怡等人[23]以此為啟示，從蚯蚓提取液中分離得到了一組平喘活性蛋白成分，分別從整體、離體實驗證明了具有顯著的平喘作用，且作用強度與孟魯司特接近并通過多種試驗手段闡明了蚯蚓蛋白是蚯蚓平喘作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。張盼盼等人[24]比較了全蝎蛋白超濾分段后各分子量段對肺腺癌細胞A549的抑制作用，篩選有效部分。結(jié)果顯示乙醇沉淀的蛋白中，其＜3kDa分子量段對A549細胞無抑制作用，3～10kDa分子量段對A549細胞的抑制作用不明顯，＞10kDa分子量段對A549細胞具有顯著的抑制作用。

近年來的研究還發(fā)現(xiàn)植物中的某些蛋白質(zhì)也具有較好的藥理活性[25]，例如，赤芝糖蛋白能刺激接種S180瘤細胞小鼠產(chǎn)生B淋巴細胞和大量的免疫因子而起到抗腫瘤作用；銀杏種子中相對分子質(zhì)量為13kDa的單鏈抗真菌蛋白，能有效抑制葡萄孢菌、褐斑病菌和尖孢鐮刀菌等真菌的生長[26]。

2 凝膠滲透色譜

2.1 凝膠滲透色譜測定分子量的原理1964年，陶氏化學(xué)公司的John C.Moore發(fā)表了關(guān)于凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）的文章[27]，標(biāo)志著這一研究大分子化合物的新手段誕生。由于凝膠具有化學(xué)惰性，它不具有吸附、分配和離子交換作用，讓被測量的高聚物溶液通過一根內(nèi)裝不同孔徑凝膠的色譜柱。當(dāng)聚合物溶液流經(jīng)色譜柱（凝膠顆粒）時，較大的分子（體積大于凝膠孔隙）被排除在粒子的小孔之外，只能從粒子間的間隙通過，速率較快；而較小的分子可以進入粒子中的小孔，通過的速率要慢得多；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介于上述兩種情況之間。經(jīng)過一定長度的色譜柱，分子根據(jù)相對分子質(zhì)量被分開，相對分子質(zhì)量大的在前面，相對分子質(zhì)量小的在后面。當(dāng)儀器和實驗條件確定后，溶質(zhì)的淋出體積與其分子量有關(guān)，分子量愈大，其淋出體積愈小。凝膠滲透色譜還有一個名字，稱之為體積排阻色譜（Size Exclusion Chromatography，SEC），文獻中兩個名稱均有使用，但其實是同一種技術(shù)。

上世紀(jì)70年代后，隨著GPC填充材料的改進[28]，色譜柱可以承受為了高效分離所需的高壓，這樣凝膠色譜法（GPC）和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）結(jié)合的產(chǎn)物-高效凝膠色譜法（High performance gel permeation chromatography，HPGPC）產(chǎn)生。多糖等高分子化合物在凝膠色譜柱上洗脫時間（Retention time，tR）和分子量大小成一定的關(guān)系，可先用已知分子量大小的高分子化合物作對照，得到一系列tR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品的tR和標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知多糖樣品的分子量大。和GPC/SEC相比，HPGPC分析時間更短，操作更加方便，重復(fù)性更好，結(jié)果可信度更高?，F(xiàn)在常用的樣品凝膠有Sephadex G系列葡聚糖、Sepharose瓊脂糖、Sephacryl丙烯葡聚糖、Bio-Gel聚丙烯酰胺凝膠等。

2.2 GPC用于中藥質(zhì)量控制的案例 生脈注射液是根據(jù)“生脈散”研制而成的中藥注射液，由紅參、麥冬、五味子組成。人參、麥冬和五味子中都含有具有重要藥理作用的多糖。劉斯亮等人研究了使用HPGPC來檢查不同的生脈注射液產(chǎn)品的產(chǎn)品的大分子物質(zhì)含量。他們采用了G4000PWXL7.8×300mm的GPC色譜柱，在柱溫35℃，流速0.6ml/min，流動相為0.01%硫酸鈉溶液（0.02%疊氮化鈉）的條件下建立了生脈注射液的分子量分布測定方法，并對8家不同批次的產(chǎn)品進行了評價和比較。檢測結(jié)果顯示不同的產(chǎn)品分子量分布不同，這說明不同產(chǎn)品的工藝不同，產(chǎn)品質(zhì)量也不同，但是如果僅適用生脈注射液現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-2865-98），鑒別項中雖然有三種原料藥材的鑒別，但是含量檢查項中只檢查人參皂甙Re的含量，難以對現(xiàn)有產(chǎn)品的質(zhì)量進行區(qū)分。

凝血酶凍干粉是從豬血中提取的凝血酶原經(jīng)激活而獲得的供口服或局部止血用的無菌凍干制品，主要成分為蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有藥品標(biāo)準(zhǔn)（中國藥典2015版）中只有效價測定。陳英紅等人[29]研究了使用HPGPC進行凝血酶凍干粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的可行性，從分子量的角度來解析該產(chǎn)品的有效性。該研究使用了蛋白專用柱TSKG2000SW（7.5×300mm，10um），流動相為pH6.86磷酸鹽緩沖液，流速0.5ml/min，柱溫30℃。在此條件下對長春遠大國奧制藥有限公司的多批凝血酶凍干粉進行了檢測。結(jié)果顯示，所建立的分子量測定方法快速、簡便和重復(fù)性好，可以為提高和完善制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

核糖核酸在基因表達等遺傳過程中起重要作用，目前在生物醫(yī)藥領(lǐng)域已有諸多應(yīng)用，如免疫核糖核酸，反義寡聚核苷酸，能提高患者免疫能力，具有抗腫瘤、抗病毒等功能，目前已有多種注射用核糖核酸產(chǎn)品上市。現(xiàn)有的核糖核酸藥品標(biāo)準(zhǔn)（如WS-10001-(HD-0829)-2002）有核糖核酸的含量檢測，但是，核糖核酸由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子，在提取和精制過程中會發(fā)生斷裂，單純測定含量并不能反映產(chǎn)品的均一性。為了測定注射用核糖核酸中核糖核酸的分子量及其分布，江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院[30]采用分子排阻色譜-多角度激光散射聯(lián)用技術(shù)，以含0.02%疊氮鈉的0.1mol·L-1氯化鈉溶液為流動相，流速0.5mL/min，采用TSKgelG2000SWXL色譜柱，柱溫為30℃建立了核糖核酸分子量測定方法。結(jié)果獲得了樣品的分子量與分子量分布等分子特征參數(shù)。測得樣品分子量（Mw）在4.6～234.2kDa，分子量分布系數(shù)（Mw/Mn）在1.3～2.9。用這一方法對上市產(chǎn)品檢測，結(jié)果表明，市售的注射用核糖核酸的分子量及分布差異均較大，而這些差異在現(xiàn)有藥品標(biāo)準(zhǔn)中并不能反映。

3 GPC用于金龍膠囊質(zhì)量控制的可行性分析

3.1 現(xiàn)代鮮藥制劑金龍膠囊 金龍膠囊是現(xiàn)代鮮藥制劑的開拓者李建生研究員在以多年臨床經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上吸收現(xiàn)代制藥技術(shù)研發(fā)的現(xiàn)代鮮藥制劑[31]。之所以說金龍膠囊是鮮藥制劑，首先，金龍膠囊是以鮮守宮、鮮金錢白花蛇和鮮蘄蛇為原料進行生產(chǎn)的，這和現(xiàn)代的絕大多數(shù)動物藥的利用方式是不一樣的[32]。其次，金龍膠囊的生產(chǎn)過程使用了和傳統(tǒng)制藥工藝不同的工藝，三種鮮藥原料首先進行切碎后，加水進行勻漿，然后勻漿液在低溫下反復(fù)凍融，從而將動物細胞破裂，釋放其中的有效成分。凍融提取液隨后經(jīng)離心粗濾超濾濃縮得到含有活性蛋白多肽和多糖等大分子和小分子的提取液，最后經(jīng)環(huán)糊精包埋和凍干得到金龍膠囊內(nèi)容物。整個工藝在低溫下進行，原料進入生產(chǎn)工藝前通過揮發(fā)性氨基氮含量測定確保原料新鮮，成品通過精氨酸酯酶活力確保產(chǎn)品保留了足夠的活性物質(zhì)[33]。

3.2 使用GPC控制金龍膠囊質(zhì)量的可行性分析 作為國內(nèi)第一個鮮動物藥制劑，金龍膠囊1998年就獲得了國家的新藥證書。在金龍膠囊的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中（WS3-158（Z-036）-2001Z），對于守宮、蘄蛇使用薄層色譜法進行了鑒定。使用揮發(fā)性堿性物質(zhì)含量測定和精氨酸酯酶活力測定對藥品的“鮮度”的測定。在含量測定方面使用了Folin-酚法對蛋白含量進行了測定。研究表明，金龍膠囊的有效成分包括蛋白、多肽、多糖、糖蛋白等[33]。在現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只有對蛋白含量的控制，但是對于蛋白和多肽的種類卻沒有任何控制，此外，作為膠囊中重要的活性成分，多糖和糖蛋白也沒有任何質(zhì)控手段。這實際上反映了大多數(shù)中藥品種的現(xiàn)實困難，想要全面定量甚至是識別藥品中的有效成分都是困難重重[34]。但是，指紋圖譜法雖然還不可能完全解決這一問題，但也給中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了一種上升的可能[35]。具體到動物藥制劑金龍膠囊，因為主要含有蛋白和多糖兩類大分子成分，所以將HPGPC技術(shù)引入到質(zhì)控過程，是非常有可能形成一個有效的手段的。目前多種上市藥品[4][13]已經(jīng)進行了相關(guān)研究，雖然最終寫入藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的還不多，但是這些研究的結(jié)果顯示了這種手段的可行性和前瞻性。和一般的以多糖或蛋白某一種成分為主要藥效成分不同，金龍膠囊同時含有兩種不同類別的大分子。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)有人研究了使用GPC同時測定多糖的分子量分布和含量[36][37]。不過，對目前上市的GPC分析柱可以看到，已有GPC分析柱可以同時分離多糖和蛋白成分，同時，文獻調(diào)研也發(fā)現(xiàn)，有人使用紫外和視差檢測器串聯(lián)同時測定多糖成分半纖維素和具有紫外吸收的木質(zhì)素大分子[38]。根據(jù)蛋白和多糖的性質(zhì)，如果在液相設(shè)備中串聯(lián)紫外檢測器和視差檢測器，也完全有可能同時獲得這兩種成分的分子量分布信息。

4 展望

金龍膠囊是一種非常有特點的中成藥。在組方上和藥材選用上繼承了傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的鮮藥使用特色，在生產(chǎn)工藝上基于鮮藥的要求，吸收了近代先進制藥加工技術(shù)手段，宗古而不泥古，造就了現(xiàn)代鮮動物藥制劑。由于中藥的復(fù)雜性，到目前為止還難以將中藥的藥效和某一種或幾種成分相對應(yīng)，因此對于中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定帶來了天然的困難。但是，通過文獻的分析也可以看出，指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)，有可能在一定的程度上為中藥成分的標(biāo)準(zhǔn)化帶來一種新的手段。而這其中，HPGPC技術(shù)也被廣泛用于中藥大分子的分子量分布研究，被嘗試用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的手段。金龍膠囊中最少含有蛋白和多糖兩大類高分子，結(jié)合不同檢測器，有可能同時將兩種分子在藥品中的分布建立一種圖譜，從而為金龍膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供新的工具。