呼 峰 李珊珊 周偉偉 胡 磊 夏登勝

隨著人口老齡化的到來，我國(guó)已開始步入老齡化社會(huì)。人隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的生理功能開始逐漸下降，口腔各組織結(jié)構(gòu)也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的增齡性變化［1］，如牙體牙周、黏膜、牙齦、頜骨、肌肉、皮膚、關(guān)節(jié)等的衰老［2］，這些組織的衰老不僅可直接導(dǎo)致老年口腔疾病, 如齲病、牙周病、黏膜病等，影響老年人進(jìn)食，進(jìn)而對(duì)全身健康造成不利影響，還可直接影響到老年人口腔疾病的診斷與治療。

胃腸是機(jī)體攝取營(yíng)養(yǎng)的主要場(chǎng)所，每天必須消化、吸收人體中的食物，以提供體內(nèi)器官與細(xì)胞足夠的養(yǎng)分。一旦腸道開始老化，全身其他組織器官也將隨之衰老。腸道衰老可導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和功能性黏膜防御缺陷、組織氧化應(yīng)激增加、保護(hù)性免疫能力下降、炎癥［3-5］，嚴(yán)重影響了老年人群的生活質(zhì)量和身體健康，同時(shí)還可直接或間接引起和加重某些器質(zhì)性疾病如消化道腫瘤、心腦血管意外和心理疾患等的發(fā)生、發(fā)展。因此，預(yù)防腸道衰老對(duì)全身系統(tǒng)及口腔健康均有重要作用。

Franceschi等［6］于2000年提出炎性衰老的概念，認(rèn)為衰老是一種慢性、無菌、低度的炎癥。Salvioli等［7］發(fā)現(xiàn)促炎癥細(xì)胞因子在衰老中起到獨(dú)特作用。有報(bào)道稱，老人體內(nèi)促炎因子的水平是年輕人的2～4倍［8］。慢性炎癥升高組織內(nèi)ROS水平，而ROS可導(dǎo)致DNA錯(cuò)誤復(fù)制、環(huán)境刺激致基因損傷［9］。此外，組織損傷促進(jìn)細(xì)胞分泌更多促炎因子［腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素（interleukin，IL）等］加重炎癥［10］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜內(nèi)炎癥和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡與腸道衰老密切有關(guān)，已發(fā)現(xiàn)部分與腸道衰老相關(guān)的促炎細(xì)胞因子，如IL-1b、IL-6和TNF-α［11-13］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）是一種具有多種功能的蛋白多肽，它廣泛存在于動(dòng)物各種正常組織細(xì)胞以及各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，可以調(diào)控細(xì)胞的遷移、粘附，刺激胞外基質(zhì)的合成，對(duì)多種類型細(xì)胞的增殖分化起促進(jìn)作用［14，15］。研究證實(shí)，TGF-β家族在衰老方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［16］。但炎癥細(xì)胞因子在腸道衰老中的具體作用仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)將通過觀察小鼠生理衰老過程中組織學(xué)及炎癥因子表達(dá)的增齡性變化，初步研究炎性細(xì)胞因子對(duì)小鼠腸道衰老的作用。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料2、6、18月齡SPF級(jí)C57雄性小鼠（北京維通利華提供）；TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 和INF-γELISA 試劑盒（達(dá)科為，中國(guó)）；CBA試劑盒（BD，美國(guó)）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑（Sigma，美國(guó)）；TGF-β1抗體（Abcam，美國(guó)）；抗兔IgG-HRP(Santa Cruz，美國(guó))；DAB 顯色試劑盒（CST，美國(guó)）；10%水合氯醛（國(guó)藥，中國(guó)）。本實(shí)驗(yàn)操作符合首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理操作要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 倒置熒光顯微鏡（Nikon，日本）；流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）；高速離心機(jī)（Thermo Fisher，美國(guó)）。

1.3 小鼠小腸上皮組織學(xué)觀察2、6、18月齡雄性C57小鼠各10只，飼養(yǎng)1周，觀察各小鼠飼養(yǎng)期間糞便性狀［17,18］；1周后10%水合氯醛（劑量0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，取小鼠胃部以下10mm 處小腸，經(jīng)多聚甲醛4℃固定過夜后脫水、浸蠟、石蠟包埋。按5μm連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯15min，100%無水乙醇3min，90%酒精3min，75%酒精3min，梯度酒精脫蠟至水。蘇木素染5min后，水洗，PBS 浸泡5min，伊紅染色2min，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4 血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè) 選取年輕小鼠（2月齡）和衰老小鼠（18月齡）各10只，10%水合氯醛（0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，取小鼠小腸，加入RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿裂解30min 后，上離心機(jī)離心，收集上清液。上清液于-80℃下保存?zhèn)溆?。采用CBA法流式檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子含量，經(jīng)相應(yīng)ELISA試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。

免疫組化：小鼠組織切片經(jīng)脫蠟浸水后，經(jīng)檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)10min。經(jīng)封閉1h，加入TGF-β1抗體孵化過夜。再加入抗兔IgG-HRP，用DAB顯色試劑盒顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J進(jìn)行分析。

1.5 TGF-β 對(duì)衰老小鼠小腸上皮的作用 選取衰老小鼠（18月齡）的小鼠20 只，隨機(jī)分為兩組，每組10 只。TGF-β 組：小鼠腹腔注射TGF-β（100ng/kg），每周注射1次，注射4次。對(duì)照組：小鼠腹腔注射生理鹽水（100ng/kg），每周注射1次，注射4次。兩組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1個(gè)月后，10%水合氯醛（劑量0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，取小鼠胃部以下10mm 處小腸，切片、HE 染色后，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，糞便性狀指數(shù)比較采用卡方檢驗(yàn)，細(xì)胞因子水平比較采用t 檢驗(yàn)，柱狀圖采用Graphpad 6.0 制作。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 衰老小鼠小腸上皮組織學(xué)改變 小鼠隨著年齡增長(zhǎng)，小腸上皮出現(xiàn)萎縮，厚度明顯減小。與2月齡及6月齡小鼠相比，18月齡小鼠糞便性狀發(fā)生改變，糞便逐漸變軟、不成型，提示衰老小鼠消化吸收功能逐步退化（圖1）。

圖1 小鼠小腸上皮組織增齡性改變A：小鼠小腸上皮2、6、18月齡組織學(xué)變化（標(biāo)尺：100μm）；B：小鼠糞便性狀改變

2.2 年輕和衰老小鼠小腸上皮中細(xì)胞因子水平變化 由圖2可知，與年輕小鼠相比，衰老小鼠小腸上皮組織中TGF-β、TNF-α、IL-2、4、6、10、17和干擾素γ（INF-γ）8種細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化。衰老小鼠組織上清液中僅TGF-β表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降，和年輕小鼠相比，差異有顯著性（P＜0.05）；而其余細(xì)胞因子表達(dá)水平均提高，其中TNF-α、IL-4和IL-6的細(xì)胞因子水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；IL-2、IL-10、IL-17和INF-γ的細(xì)胞因子水平?jīng)]有顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 小鼠小腸免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示：年輕小鼠小腸上皮層、黏膜下層、肌層和漿膜均有大量TGF-β表達(dá)，其中在管狀腸腺的底部TGF-β高表達(dá)，提示TGF-β可能與小腸上皮的細(xì)胞更新密切相關(guān)。衰老小鼠小腸各區(qū)域中TGF-β表達(dá)水平明顯低于年輕小鼠（P＜0.05）（圖3）。

圖2 年輕小鼠和衰老小鼠小腸上皮中細(xì)胞因子水平A:TGF-β；B：TNF-α；C：IL-2；D：IL-4；E：IL-6；F：IL-10；G：IL-17；G：INF-γ

圖3 年輕小鼠和衰老小鼠小腸上皮A：年輕小鼠免疫組化結(jié)果（標(biāo)尺：100μm）；B：衰老小鼠免疫組化結(jié)果（標(biāo)尺：100μm）；C：小腸上皮中TGF-β表達(dá)水平

2.4 TGF-β對(duì)衰老小鼠小腸上皮的作用結(jié)果

利用衰老小鼠腹腔注射TGF-β，1個(gè)月后組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TGF-β注射組小鼠小腸上皮萎縮明顯改善，厚度明顯增高。ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β組衰老小鼠小腸組織中TGF-β的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)TGF-β組小鼠的糞便成型，較對(duì)照組有明顯改善（P＜0.05）。說明TGF-β可以促進(jìn)衰老小鼠小腸上皮的吸收功能，延緩衰老進(jìn)程。

圖4 衰老小鼠腹腔注射TGF-β 1個(gè)月后的變化A:對(duì)照組和TGF-β組的鏡下結(jié)果（標(biāo)尺：200μm）；B：對(duì)照組和TGF-β組組織上清液中TGF-β的表達(dá)水平；C：對(duì)照組和TGF-β組小鼠糞便性狀指數(shù)

3.討論

衰老是生物的自然變化規(guī)律，隨著年齡增長(zhǎng)，人體器官功能逐步減退。老年人因牙周炎缺牙而導(dǎo)致咀嚼功能下降［19］，舌乳頭減少使味覺改變，唾液腺腺泡減少和萎縮而導(dǎo)致口干［2，20，21］，進(jìn)而影響全身健康。而且老年人普遍存在消化吸收和免疫功能減退的情況，會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)攝取，與小腸上皮黏膜的變化有密切聯(lián)系［22］。炎癥細(xì)胞因子既參與口腔黏膜的凋亡，同時(shí)也可以促進(jìn)黏膜的重建和修復(fù)［23，24］，但炎癥細(xì)胞因子是對(duì)于腸道衰老的機(jī)制尚不完全清楚。

本研究觀察到小鼠正常生理衰老情況下小腸上皮出現(xiàn)萎縮，糞便性狀改變，呈現(xiàn)出變軟和不成型的形態(tài)，說明小鼠小腸隨著年齡增長(zhǎng)，小腸消化吸收功能減退，這跟小鼠小腸上皮黏膜細(xì)胞增殖能力下降，增殖減慢，杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)目減少有關(guān)［22，25］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小腸上皮干細(xì)胞線粒體DNA的突變與年齡有關(guān)，這種基因突變會(huì)影響小腸上皮干細(xì)胞呼吸鏈的功能進(jìn)而加速細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜的厚度在老化過程中逐漸下降［26］。為了證實(shí)和篩選影響小鼠腸道功能的炎癥細(xì)胞因子，本研究對(duì)小鼠小腸上皮組織上清液中細(xì)胞因子進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)和ELISA 檢測(cè)，篩選出TGF-β、TNF-α、IL-2、4、6、10、17和INF-γ8種細(xì)胞因子。本研究中衰老小鼠小腸中TGF-β比年輕小鼠明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余細(xì)胞因子表達(dá)水平均較年輕小鼠提高，其中TNF-α、IL-4和IL-6的細(xì)胞因子水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IL-2、IL-10、IL-17和INF-γ的細(xì)胞因子水平?jīng)]有顯著性差異。說明在小鼠小腸上皮增齡性變化中TGF-β、TNF-α、IL-4和IL-6可能起到了一定作用。

TGF-β是一類具有強(qiáng)烈刺激細(xì)胞增殖分化的生長(zhǎng)因子，具有廣泛的靶細(xì)胞，對(duì)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的生物學(xué)作用［27］。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β是間充質(zhì)干細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)分子，影響干細(xì)胞的增殖，自我更新與多向分化［28，29］，對(duì)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、衰老、腫瘤發(fā)生等生長(zhǎng)調(diào)控及創(chuàng)傷愈合起到重要作用。TGF-β可以促進(jìn)口腔黏膜重建和修復(fù)，延緩口腔黏膜的細(xì)胞衰老。有研究證實(shí)，TGF-β1能促進(jìn)大鼠口腔黏膜固有層前體細(xì)胞的分化，提高細(xì)胞基質(zhì)分泌和礦化能力［17］。TNF-α是一種重要的促炎因子和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，在炎癥反應(yīng)及骨病理、生理過程中起重要的作用，并且炎癥因子可以通過多種復(fù)雜信號(hào)通路調(diào)控干細(xì)胞的生物學(xué)特性［30］。白細(xì)胞介素是一類來源于單核-巨噬細(xì)胞的多功能生物活性物質(zhì)，屬于前炎癥細(xì)胞因子，能夠引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［31］。INF-γ屬于Th1型細(xì)胞因子，其主要用于介導(dǎo)免疫應(yīng)答［32］。何玉廷等［33］發(fā)現(xiàn)，IL-4、IL-6和TNF-α均被作為炎性衰老的血清學(xué)標(biāo)志物。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SD大鼠血清中IL-2含量降低，18、24月齡開始差異有顯著性， IL-6、IL-10含量逐漸升高，24月齡時(shí)差異有顯著性， IL-4，INF-γ含量未見明顯改變［34］。向婷婷等［35］發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-17、TNF-α和INF-γ的表達(dá)隨著大鼠年齡的增長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加。上述實(shí)驗(yàn)說明小鼠小腸上皮增齡性改變可能存在多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)只選擇TGF-β一種細(xì)胞因子進(jìn)行初步研究。

本研究免疫組化驗(yàn)證，衰老小鼠小腸上皮表達(dá)的TGF-β有明顯減少。衰老小鼠腹腔注射TGF-β后，小腸上皮中TGF-β含量得到明顯提升，小鼠小腸上皮黏膜萎縮和糞便性狀均得到改善，說明TGF-β具有延緩小鼠小腸上皮衰老的作用，可以促進(jìn)小腸營(yíng)養(yǎng)吸收。生長(zhǎng)分化因子11（GDF11）是TGF-β家族的一員，在多種器官和組織中表達(dá)，TGF-β/Smad通路通過激活p21基因誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯來干預(yù)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育期間的程序性衰老，可延緩心臟、骨骼肌、大腦、骨骼、血管等多個(gè)器官和組織的衰老進(jìn)程［36］，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

研究機(jī)體衰老對(duì)于全身健康，特別是對(duì)老年人的生活質(zhì)量有著重要意義。通過研究衰老小鼠小腸組織形態(tài)學(xué)和炎癥因子水平變化，以及TGF-β對(duì)小腸上皮衰老的延緩作用，小腸營(yíng)養(yǎng)吸收功能得到改善，對(duì)于機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡有著積極的作用。本實(shí)驗(yàn)僅研究了TGF-β在衰老小鼠腸道功能退化中的影響，今后的實(shí)驗(yàn)中還會(huì)深入研究其他細(xì)胞因子對(duì)口腔黏膜以及腸道上皮的調(diào)節(jié)機(jī)制。