韓文莉，趙學(xué)科，張立國，雷玲玲，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，李志強(qiáng)，劉太江，張高富，李秀敏，陳志國，王立東

食管癌發(fā)病率在上消化道腫瘤中居第2位[1]，我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，顯著的地域性分布差異是我國食管癌突出的流行病學(xué)特征之一，河南、河北和山西交界的太行山地區(qū)食管癌尤為高發(fā)[2]。食管癌患者早期無特異癥狀，缺乏高危人群預(yù)警篩查和早期發(fā)現(xiàn)的有效指標(biāo)和方法，導(dǎo)致其預(yù)后極差，中晚期5 a生存率僅為20%左右[3]。食管癌液體活檢是近年提出的一種腫瘤無創(chuàng)診斷技術(shù)，主要包括腫瘤相關(guān)抗原和蛋白檢測、高易感基因及其蛋白產(chǎn)物檢測、游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測、外泌體及循環(huán)RNA(Circulating RNA)檢測等。食管癌是一個多階段演進(jìn)的過程，隨著疾病的進(jìn)展，這些標(biāo)志物會釋放入血，通過分析血液中這些小分子標(biāo)志物，來實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期篩查、分子分型、預(yù)后、用藥指導(dǎo)以及復(fù)發(fā)監(jiān)測等。本研究通過檢測血清中自身抗體，對高發(fā)區(qū)無癥狀人群進(jìn)行多中心篩查應(yīng)用，為無癥狀高危人群預(yù)警篩查提供重要依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

①收集100例原發(fā)性早期食管癌患者的血清(食管癌組)以及100例正常人的血清(對照組)。100例早期食管癌患者中，男性54例，女性46例，年齡39～77(60.4±7.4)歲；100例正常人中，男性50例，女性50例，年齡35～69(51.9±9.8)歲。所有食管癌患者血清都是在術(shù)前收集，診斷時間為2010年1月至2015年12月。正常人血清來自門診胃鏡并經(jīng)活檢病理確診為非癌或非癌前病變的健康人群。②接受流行病學(xué)調(diào)查的431位無癥狀居民來自新鄉(xiāng)市輝縣市食管癌高發(fā)區(qū)，男性230例，女性201例，年齡35～81(52.1±9.2)歲，中位年齡51歲。流行病學(xué)調(diào)查和血液樣品的收集由衛(wèi)生院檢驗(yàn)科醫(yī)師和當(dāng)?shù)卮甯刹亢痛遽t(yī)協(xié)助完成。所有研究對象均排除影響血清自身抗體表達(dá)的疾病，如感染、過敏及自身免疫性疾病等。③大規(guī)模應(yīng)用人群為2014年至2019年新鄉(xiāng)市輝縣市35歲以上無癥狀者，均無自身免疫性疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血液樣品的收集及保存對所選取的研究對象取靜脈血5 mL(空腹)置于離心管中，室溫靜置30 min后，2 000 r·min-1離心20 min，每管吸取血清100L進(jìn)行分裝，放置液氮中保存，而后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱。

1.2.2 血清自身抗體檢測應(yīng)用美國Scripps研究所提取和純化的MDM2、GST和STAT3 3種抗原聯(lián)合檢測收集的血清標(biāo)本。使用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5g·L-1，血清標(biāo)本稀釋濃度為1∶100，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG稀釋濃度為1∶3 000。在ELISA板孔中加入稀釋后的抗原每孔100L，4 ℃，過夜。加入稀釋后的血清每孔100L，每個樣品同步設(shè)置2個復(fù)孔，37 ℃孵育1 h。陽性對照為已知陽性血清，陰性對照為包被緩沖液。先加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 每孔100L，37 ℃孵育30 min；再加入TMB底物顯色液，每孔100L，37 ℃避光反應(yīng)10 min，直至陽性對照顏色明顯變化后，每孔再加入終止液50L，終止反應(yīng)，并在ELISA 檢測儀上讀取OD450光密度值。

1.2.3 血清自身抗體檢測結(jié)果判定采用Scripps研究所判定方法，即正常血清OD讀數(shù)均數(shù)±3個標(biāo)準(zhǔn)差，為Cut-off值(截?cái)嘀?，大于此值為陽性，小于此值為陰性[4-5]。

1.2.4 食管內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢對血清學(xué)檢測陽性者(3種自身抗體中有至少1種為陽性)進(jìn)行內(nèi)鏡檢查，并常規(guī)在食管中段、下段各取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機(jī)取材，必要時行碘染色。在食管不染區(qū)取材，并均迅速置95%乙醇固定。常規(guī)脫水包埋后連續(xù)切片9張(厚5m)，其中1張作HE核實(shí)組織診斷，剩余8張作免疫組化。

1.2.5 病理組織學(xué)和免疫組化檢查將食管上皮根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)分為正常、癌前病變和食管癌。采用免疫組化法檢測食管組織中上述3種相關(guān)抗體。免疫蛋白陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，為棕黃色或棕褐色，高倍鏡下視野中無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性；陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性。

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)的陽性表達(dá)率食管癌和對照組人群血清自身抗體陽性檢出率差異顯著，見表1。3種自身抗體聯(lián)合檢測價(jià)值最高，見表2。

表1 兩組血清自身抗體MDM2、GST、STAT3陽性檢出率比較

表1 兩組血清自身抗體MDM2、GST、STAT3陽性檢出率比較

表2 各指標(biāo)的診斷價(jià)值

2.2 腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測和食管內(nèi)鏡檢查結(jié)果應(yīng)用酶聯(lián)免疫測定法共檢測431例食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀居民血清3種腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體水平，受檢人群的基本特征見表3。結(jié)果3個腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體血清陽性監(jiān)測指標(biāo)中，至少有1項(xiàng)呈陽性反應(yīng)的89例，陽性表達(dá)率為20.65%(89/431)，聯(lián)合檢出率明顯高于任何單個指標(biāo)檢出率，P<0.05。見表4。

表3 食管癌高發(fā)區(qū)431例無癥狀受檢人群性別與年齡分布 例(%)

表4 血清自身抗體表達(dá)對比食管內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果 例(%)

2.3 高危人群推廣應(yīng)用結(jié)果在8 802例無癥狀人群中，1 584例至少有一項(xiàng)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達(dá)陽性，占總?cè)藬?shù)的18.00%。對這1 584例抗體表達(dá)陽性的人群全部行色素內(nèi)鏡檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌前病變352例(4.00%，352/8 802)，食管癌210例(2.39%，210/8 802),早期食管癌198例，賁門癌2例(0.02%，2/8 802)，其余1 020例均正常。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)MDM2、GST和STAT3聯(lián)合檢測食管癌的敏感度達(dá)85%，特異性達(dá)70%，可以有效地發(fā)現(xiàn)早期食管癌。利用這3種抗體對省內(nèi)小范圍食管癌高發(fā)區(qū)的無癥狀人群行血清學(xué)自身抗體檢測，經(jīng)內(nèi)鏡和組織病理學(xué)檢查證實(shí)，顯著提高了食管癌的檢出率?？贵w表達(dá)陰性組342例人群中，食管癌僅1例。這一結(jié)果表明，利用血清自身抗體聯(lián)合檢測并結(jié)合內(nèi)鏡和黏膜活檢可能是食管癌早期發(fā)現(xiàn)的重要途徑。該方法可用于大規(guī)模無癥狀人群的篩查，優(yōu)勢是大大降低了檢查成本，受檢者痛苦小，容易被接受，臨床檢查周期短，技術(shù)含量要求低。然而，僅靠血清學(xué)檢測仍不能準(zhǔn)確定位食管癌患者，自身抗體定性仍需結(jié)合內(nèi)鏡和黏膜活檢。在血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，對高危人群行內(nèi)鏡和黏膜組織活檢可能是目前對食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群進(jìn)行大范圍普查較好的方案。腫瘤的發(fā)展是一個多階段演進(jìn)的過程，正常組織發(fā)生癌變后，不同腫瘤的病理類型間存在差異，同種病理類型之間有腫瘤的異質(zhì)性，所以，僅采用單一指標(biāo)無法對腫瘤做出準(zhǔn)確的診斷，聯(lián)合檢測多種相關(guān)自身抗體可顯著增加食管癌的檢出率。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果篩選這3種腫瘤相關(guān)自身抗體對食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群進(jìn)行篩查。

MDM2在腦膜瘤、食管癌、胃癌等多種腫瘤中表達(dá)，與食管癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后關(guān)系密切[6]。趙仲生等研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中有MDM2蛋白過表達(dá)，提示MDM2癌基因產(chǎn)物的過表達(dá)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。李玉琴等闡明MDM2表達(dá)可引起胃上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，抑制MDM2表達(dá)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞凋亡，并抑制其侵襲，從而發(fā)揮抑制胃癌生長和胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)室研究也發(fā)現(xiàn)MDM2與食管癌相關(guān)[9]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，即STAT3的主要作用是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時也對輔助性T細(xì)胞17(Th17)的分化起關(guān)鍵作用。武玉霞等研究發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白表達(dá)影響正常妊娠[12]，許爽等研究表明STAT3在動脈粥樣硬化中起重要作用[13]，李福青等研究發(fā)現(xiàn)STAT3與結(jié)直腸腺癌密切相關(guān)[14]，王健等證明STAT3與食管癌病理特征相關(guān)[15]。

腫瘤細(xì)胞具有高速占位性增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，基本可自我免疫耐受。腫瘤相關(guān)抗原在正常組織細(xì)胞中也可有微量合成，并不是腫瘤細(xì)胞特有，兩者僅有表達(dá)量的差異，因此稱為相關(guān)抗原，針對這些抗原，機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體。

從實(shí)驗(yàn)室研究到用于高發(fā)區(qū)無癥狀高危人群，本研究的方法比過去沒有液體活檢更好，但仍然存在一定的局限性，假陽性、假陰性仍然不可避免，需要優(yōu)化組合更多的指標(biāo)進(jìn)一步探討，比如食管癌相關(guān)的基因、蛋白、自身抗體、miRNA、甲基化等。由于同一種腫瘤中可同時出現(xiàn)不同的腫瘤標(biāo)志物，同一標(biāo)志物也可在多種腫瘤中均有表達(dá)量的變化，所以聯(lián)合檢測多種血清腫瘤相關(guān)自身抗體將有助于提高早期食管癌的檢出率。自身抗體檢測聯(lián)合內(nèi)鏡黏膜活檢可能是食管癌早期發(fā)現(xiàn)的重要手段。