趙學(xué)科，馬 磊，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢(mèng)霞，韓文莉，雷玲玲，孟超龍，庫(kù)建偉，任書(shū)偉，張冬云，王立東

早期食管癌5 a生存率可高達(dá)90%[1]，然而早期食管癌患者無(wú)特異性臨床癥狀，導(dǎo)致臨床就診的食管癌患者中90%以上為中晚期，其5 a生存率僅為20%左右[2]，因此，食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)成為降低食管癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)鏡普查有成本高、創(chuàng)傷大、重復(fù)性檢查、患者依從性低且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師等不足，很難在高發(fā)區(qū)大規(guī)模無(wú)癥狀人群篩查中推廣應(yīng)用。

液體活檢是近年興起的一種無(wú)創(chuàng)、高效的腫瘤篩查技術(shù)[3-4]，主要包括腫瘤相關(guān)抗原和蛋白檢測(cè)、高易感基因及其蛋白產(chǎn)物檢測(cè)、游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)[5]檢測(cè)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)檢測(cè)等[6-7]。食管癌變是一個(gè)多階段演進(jìn)過(guò)程，早期病變以食管上皮細(xì)胞過(guò)度增生為特征，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為基底細(xì)胞過(guò)度增生(basal cell hyperplasia, BCH)、不典型增生(dysplasia,DYS)和原位癌。近年研究提示，食管癌前病變形態(tài)改變之前已發(fā)生多種基因和蛋白的變化[8]，包括來(lái)自腫瘤細(xì)胞的一組特異蛋白，后者可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)(自身抗體)，這一組蛋白被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)抗原(tumour-associated antigens,TAAs)。因此，無(wú)癥狀人群血清腫瘤相關(guān)自身抗體檢測(cè)作為一種重要的檢測(cè)指示，有助于食管癌高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)。本研究旨在對(duì)發(fā)現(xiàn)的食管癌相關(guān)抗原自身抗體進(jìn)行組合、優(yōu)化，在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行多中心無(wú)癥狀人群普查，以實(shí)現(xiàn)食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)，降低人群篩查成本，提高食管癌患者生存期。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象第一組實(shí)驗(yàn)組人群來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集的食管癌患者的血清標(biāo)本215例，患者經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為食管癌，采樣前均未接受放療和化療治療。其中男109例，女106例；年齡 37～70(59±7.3)歲。對(duì)照組為來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，其性別和年齡與實(shí)驗(yàn)組相匹配。第二組人群為食管癌高發(fā)區(qū)河南省新鄉(xiāng)市輝縣市鄭屯村自愿接受流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查的35歲以上無(wú)癥狀居民589例，其中男299例，女290例；年齡35～70(51±8.5)歲。第三組為2010年至2019年食管癌高發(fā)區(qū)河南南陽(yáng)、信陽(yáng)地區(qū)的19 986例35歲以上無(wú)癥狀人群，行液體活檢，并對(duì)高危人群行色素內(nèi)鏡、病理活檢檢查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血樣采集研究對(duì)象填寫(xiě)基本信息調(diào)查表，并收集空腹靜脈血5 mL，之后將其置于離心管內(nèi)，在室溫下靜置30 min后以2 000 r·min-1，離心20 min，吸取血清，每管100 μL分裝，-80 ℃保存。

1.2.2 血清自身抗體測(cè)定采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg·μL-1，血樣稀釋濃度為1∶50，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG稀釋濃度為1∶5 000。向酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)板孔中加入用包被稀釋液稀釋過(guò)的抗原，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜(24 h以上)。加入稀釋后的病人血清，每孔100 μL，每個(gè)樣品至少做2次檢測(cè)，37 ℃孵育1 h。已知陽(yáng)性的血清為陽(yáng)性對(duì)照，包被緩沖液為陰性對(duì)照。加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。加入TMB過(guò)氧化脲顯色液，每孔100 μL，置37 ℃避光反應(yīng)10 min，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，并在ELISA檢測(cè)儀上讀取A450吸光度值。

1.2.3 血清檢測(cè)結(jié)果判定采用Scripps研究所判定方法，即以正常血清A450讀數(shù)的均數(shù)±3標(biāo)準(zhǔn)差為Cut-off值(截?cái)嘀?，讀數(shù)在此值以上的為陽(yáng)性，否則為陰性。有一項(xiàng)自身抗體表達(dá)陽(yáng)性時(shí)，該受試者即定義為食管癌高危人群。

1.2.4 蛋白芯片分析針對(duì)19 986例35歲以上無(wú)癥狀人群，采用人蛋白質(zhì)組定制芯片V3.0(CDI Laboratories)檢測(cè)。每個(gè)芯片上包含Rb、MDM2、Bcl-2純化蛋白質(zhì)微陣列。每張蛋白芯片可同時(shí)檢測(cè)96例人體血清。從-80 ℃取出微陣列，在阻斷緩沖液(3%BSA在PBS)中室溫孵育3 h。然后將血清樣本以1∶2 000的比例在結(jié)合緩沖液(1%)中稀釋?zhuān)瑢SA(PBST)加入微陣列中孵育，4 ℃過(guò)夜。PBST洗滌后，微陣列與1∶1 000稀釋熒光標(biāo)記山羊抗人IgG(532 nm)在室溫避光反應(yīng)1 h。PBST洗滌后，對(duì)微陣列用ddH2O沖洗并干燥。用GenePix Pro6.0(Axon儀器，加拿大)提取每個(gè)免疫熒光點(diǎn)的強(qiáng)度，判斷抗原抗體免疫反應(yīng)[9]。

1.2.5 色素內(nèi)鏡檢查常規(guī)行食管黏膜碘染色，在食管黏膜不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于85%乙醇內(nèi)固定。

1.2.6 病理組織學(xué)檢查對(duì)胃鏡獲取的活檢組織常規(guī)處理后，每張切片厚3 μm，HE染色，作組織病理學(xué)診斷。

2. 結(jié)果

2.1 3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在食管癌和對(duì)照組血清中的檢測(cè)情況見(jiàn)表1。Rb、MDM2和Bcl-2這3種腫瘤抗原自身抗體在食管癌患者和正常對(duì)照人群血清中的陽(yáng)性檢出率(靈敏度)分別為35.81%、32.09%和45.58%，特異度分別為93.49%、94.88%和92.09%；Rb+ MDM2、MDM2+ Bcl-2和Rb+ Bcl-2兩種腫瘤抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)，在食管癌患者和正常人群血清中陽(yáng)性(至少一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性)檢出率(靈敏度)分別為51.16%、61.86%和67.44%，特異度分別為92.56%、91.63%和90.23%。Rb、MDM2和Bcl-2這3種腫瘤抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)，在食管癌患者和正常對(duì)照人群血清中陽(yáng)性(至少一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性)檢出率(靈敏度)高達(dá)84.65%，特異度為82.33%。

表1 3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在食管癌和健康對(duì)照組人群血清中檢測(cè)結(jié)果自身抗體

2.2 3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)食管癌高發(fā)區(qū)589例無(wú)癥狀人群篩查見(jiàn)表2。589例無(wú)癥狀人群血清中3種腫瘤抗原自身抗體(至少一個(gè)指標(biāo))陽(yáng)性檢出率為20.90%，共檢出125例食管癌高危人群和473例非高危人群；對(duì)589例無(wú)癥狀人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理檢查，125例食管癌高危人群中共確診13例(10.40%)早期食管癌、30例(24.00%)各級(jí)癌前病變患者；464例非高危人群中確診2例早期食管癌和6例癌前病變患者，3種自身抗體血清陽(yáng)性人群(高危人群)中早期食管癌和癌前病變患者檢查率明顯高于陰性組人群，P<0.001，其靈敏度高達(dá)84.65%。

表2 3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)及色素內(nèi)鏡、病理活檢對(duì)589無(wú)癥狀人群高危人群篩查結(jié)果對(duì)比

2.3 高發(fā)區(qū)19 986無(wú)癥狀人群高危人群篩查使用3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)19 986例無(wú)癥狀人群，共檢測(cè)到至少一項(xiàng)自身抗體陽(yáng)性的高危人群3 624例，其中早期食管癌373例(1.87%)，各級(jí)癌前病變1 352例(6.76%)，中晚期食管癌21例(0.11%)，其他上消化道腫瘤36例(1.80%)。該組人群早期食管癌及癌前病變患者色素內(nèi)鏡及病理活檢檢出率與589例無(wú)癥狀人群的檢出率相近。

3 討論

腫瘤細(xì)胞生物學(xué)具有復(fù)雜多態(tài)的特性，同種腫瘤病理類(lèi)型的差異、同種病理類(lèi)型腫瘤的異質(zhì)性等原因都造成了癌變過(guò)程中產(chǎn)生不同的抗原，通過(guò)多個(gè)腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合檢測(cè)自身抗體有助于提高食管癌的檢出率[10-11]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明食管癌相關(guān)抗原Rb、MDM2、Bcl-2存在明確的自身抗體[12]，本研究檢測(cè)了3種食管癌相關(guān)抗原自身抗體的不同聯(lián)合檢測(cè)方法在食管癌高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)中的差異。單個(gè)自身抗體陽(yáng)性時(shí)，發(fā)生食管癌變的風(fēng)險(xiǎn)是自身抗體陰性人群的7倍多，其靈敏度只有32.09%，而當(dāng)3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，只要其中一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性，就確定為食管癌高危人群，而此時(shí)高危人群發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)較陰性組高出25倍多，且敏感性和特異性高達(dá)84.65%和82.33%，從而證實(shí)多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)判斷食管癌高危人群風(fēng)險(xiǎn)的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)。

本研究對(duì)589例無(wú)癥狀人群進(jìn)行食管癌相關(guān)抗原Rb、MDM2、Bcl-2這3種自身抗體液體活檢，并篩選出高危人群，然后對(duì)所有無(wú)癥狀人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，并取食管黏膜上皮做病理學(xué)檢測(cè)和診斷，兩種方法比較后發(fā)現(xiàn)：液體活檢方法確定的高危人群中早期食管癌和各級(jí)癌前病變占所有早期食管癌和各級(jí)癌前病變患者的84.31%，用色素內(nèi)鏡和病理活檢確診的方法再次證明了本研究利用Rb、MDM2、Bcl-2這3種食管癌自身抗體作為液體活檢指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)食管癌高危人群的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，用食管癌高發(fā)區(qū)19 986例無(wú)癥狀人群進(jìn)行大規(guī)模驗(yàn)證，也再次證實(shí)了以上結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，利用Rb、MDM2、Bcl-2這3種食管癌自身抗體作為液體活檢技術(shù)篩選出的食管癌高危人群占全部無(wú)癥狀人群的20%左右，可減少80%的無(wú)癥狀人群胃鏡篩查，大大節(jié)約了醫(yī)療資源，減少了大量不必要的陪伴檢查和重復(fù)檢查，受檢者也更容易接受。

然而，該組指標(biāo)陽(yáng)性的高危人群中，仍有一半左右的無(wú)病變?nèi)巳?，色素?nèi)鏡和活檢病理檢查均無(wú)異常，并且在指標(biāo)檢測(cè)為陰性的無(wú)癥狀人群中，仍有一小部分人最終發(fā)展為食管癌。在一定程度上，顯露出本組液體活檢分子在食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)中出現(xiàn)的假陽(yáng)性和假陰性，仍需對(duì)液體活檢分子指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化、組合，比如食管癌相關(guān)的基因、蛋白、自身抗體、miRNA、甲基化等分子指標(biāo)。

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段演進(jìn)的過(guò)程，是多種基因參與的復(fù)雜性疾病，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)這種腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體，是目前研究進(jìn)展最為迅速的一種腫瘤標(biāo)志物。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有良好的特異性、較高的敏感度，能夠明確地區(qū)分腫瘤患者和非腫瘤患者。自身抗體存在于患者的血液、細(xì)胞或組織中，可通過(guò)免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法測(cè)定其含量，對(duì)腫瘤的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)具有一定的價(jià)值。通過(guò)血清學(xué)檢查自身抗體，使得早期診斷腫瘤成為一種可能。