吳寶升，張崇志△，孫海洲*，桑 丹*，李勝利，張春華，金 鹿，斯登丹巴，谷 英

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

功能性氨基酸在動(dòng)物機(jī)體具有合成蛋白質(zhì)及多種生物活性物質(zhì)的生理功能，尤其在母畜妊娠期階段扮演著重要的角色。功能性氨基酸家族主要包括精氨酸(Arg)、谷氨酰胺、谷氨酸、支鏈氨酸、色氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和?；撬岬萚1-2]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作為內(nèi)源Arg生成激活劑，具有內(nèi)源性Arg合成的限制酶激活劑和多種生物活性物質(zhì)的功能。NCG能夠通過(guò)參與二氫吡咯-5-羧酸合成酶和氨甲酰磷酸合成酶I的激活，促使谷氨酰胺合成瓜氨酸，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性精氨酸(Arg)的合成[3]。谷氨酰胺和Arg能夠通過(guò)AMPK、cGMP和mTOR等信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)底物氧化和蛋白質(zhì)合成[4]，在妊娠前期母畜胚胎和胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[5]。

目前研究表明，動(dòng)物繁殖期日糧中添加NCG不僅促進(jìn)內(nèi)源Arg合成、調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合理分配，也能有效降低胚胎損失、促進(jìn)胎兒發(fā)育及提高母畜繁殖率[4，6-8]。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠早期補(bǔ)充0.4%NCG可以促進(jìn)黃體形成，降低胚胎死亡率；妊娠后期日糧中補(bǔ)充0.08%的NCG相比對(duì)照組分別提高窩產(chǎn)活仔數(shù)11.75%和窩產(chǎn)活仔總重量13.23%，日糧中添加0.08%NCG和1%Arg都顯著提高血漿Arg濃度。Kwon等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠早-中期階段靜脈灌注Arg提高母羊子宮液和尿囊液中Arg和瓜氨酸含量，改善胚胎存活率。Lassal等[11]研究多胎母羊灌注Arg試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，出生羔羊死亡率降低23%，羔羊存活率增加59%，四胞胎出生體重提高23%。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于NCG對(duì)母羊妊娠前期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方面的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在日糧中添加不同劑量的NCG，研究NCG對(duì)妊娠前期鄂爾多斯細(xì)毛羊血液、尿囊液和羊水中氨基酸濃度的影響，為鄂爾多斯細(xì)毛羊妊娠期繁殖性能的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇體況良好，2～3周歲，平均體重為(50.62±0.52)kg的受孕鄂爾多斯細(xì)毛羊母羊40只隨機(jī)分為3組，各組試驗(yàn)?zāi)秆蝮w重經(jīng)F檢驗(yàn)差異均不顯著(P>0.05)。

1.2 試驗(yàn)期

本試驗(yàn)于鄂爾多斯細(xì)毛羊妊娠期開(kāi)始至妊娠期第90 d結(jié)束，整個(gè)試驗(yàn)期90 d。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平的設(shè)定

試驗(yàn)?zāi)秆蚧A(chǔ)日糧配制參考NRC(2007)：按照母羊妊娠前期飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)配方，日糧的營(yíng)養(yǎng)組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis)

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理

飼喂NRC(2007)推薦的基礎(chǔ)日糧(滿足妊娠雙胎母羊需要量為26.2 g/kg體重)，再與不同濃度NCG進(jìn)行混勻，每只母羊單獨(dú)套袋飼喂，準(zhǔn)確記錄供給飼喂量和剩料量。40只試驗(yàn)?zāi)秆螂S機(jī)分為3組，NCG1組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.30 g NCG/d(n=13),NCG2組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.40 g NCG/d(n=13)，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧(n=14)。每日上午8:00和下午17:00飼喂兩次，自由飲水。NCG添加劑量參考本團(tuán)隊(duì)前期的試驗(yàn)結(jié)果。每天清掃羊圈、清除糞便、清洗飲水池，確保周圍環(huán)境的清潔。

1.5 取樣方法

妊娠期第0 d、45 d和90 d，對(duì)試驗(yàn)?zāi)秆蜻M(jìn)行稱重，根據(jù)體重變化及時(shí)調(diào)整母羊的日糧供給量。妊娠期第45 d和90 d，分別每組3只母羊進(jìn)行屠宰，立即取出子宮、剝離尿囊絨膜和羊膜，用50 mL注射器抽取尿囊液和羊水并測(cè)量體積，記錄胎兒體重。妊娠期第45 d和90 d每組6只試驗(yàn)?zāi)秆蝾i靜脈采血、妊娠期90 d胎兒心臟采血，使用含肝素鈉的離心管分別收集母羊和胎兒血液10 mL，3 500 rpm離心15 min，取上清液并-20 ℃冷凍保存待測(cè)。

1.6 氨基酸的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸濃度，由北京普瑞華盛生物科技有限公司通過(guò)高效液相色譜-四級(jí)桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS API3200 Q-TRAP)檢測(cè)血漿游離氨基酸濃度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SAS9.0一般線性模型統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±SEM表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加NCG對(duì)妊娠前期母羊體重、胎兒體重、尿囊液量及羊水量的影響

由表2可知，妊娠期第0 d和45 d，對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊體重沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；妊娠期第90 d，NCG2組母羊體重最高，達(dá)到61 kg，但與對(duì)照組和NCG1組母羊體重差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第45 d，對(duì)照組、NCG1組和NCG2組胎兒體重沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；妊娠期第90 d，NCG1組胎兒體重最高，達(dá)到537.50 g，但與對(duì)照組和NCG2組胎兒體重差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第45 d和90 d，對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊尿囊液和羊水含量均呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，但其差異均不顯著(P>0.05)。

表2 妊娠前期母羊體重、胎兒體重、尿囊液量及羊水量變化情況 Table 2 Changes of maternal body weight, fetal weight, allantoic fluid and amniotic fluid in pre-pregnancy

2.2 日糧添加NCG對(duì)妊娠前期母羊血漿氨基酸濃度的影響

由表3可知，妊娠期第45天，NCG2組母羊血漿中瓜氨酸和鳥氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05)、極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；對(duì)照組、

表3 妊娠期第45天和90天母羊血漿中氨基酸濃度的變化Table 3 Changes of amino acids concentrations in maternal plasma at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L

NCG1組和NCG2組母羊血漿中脯氨酸、天冬酰胺、色氨酸、β-丙氨酸和亮氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，纈氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、Arg和牛黃氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第90天，對(duì)照組母羊血漿中甘氨酸和甲硫氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05)，NCG2組絲氨酸和Arg濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NCG1組和NCG2組谷氨酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊血漿中丙氨酸和天冬酰胺濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，半胱氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

2.3 日糧添加NCG對(duì)妊娠前期母羊尿囊液中氨基酸濃度的影響

由表4可知，妊娠期第45 d，NCG1組和NCG2組母羊尿囊液中谷氨酰胺濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊尿囊液中甘氨酸、丙氨酸、牛黃氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，天冬酰胺、谷氨酸、色氨酸、賴氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸和亮氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第90 d，對(duì)照組母羊尿囊液中甲硫氨酸濃度顯著高于NCG2組(P<0.05)，對(duì)照組組氨酸濃度顯著高于NCG1組和NCG2組(P<0.05)，NCG2組和NCG1組Arg濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NCG1組鳥氨酸濃度顯著高于NCG2組(P<0.05)和對(duì)照組(P<0.01)，NCG1組蘇氨酸和半胱氨酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊尿囊液中甘氨酸、絲氨酸、色氨酸和賴氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，異亮氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 妊娠期第45和90天母羊尿囊液中氨基酸濃度的變化Table 4 Changes of amino acids concentrations in maternal allantoic fluid at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L

2.4 日糧添加NCG對(duì)妊娠前期母羊羊水中氨基酸濃度的影響

由表5可知，妊娠期第45 d，對(duì)照組母羊羊水中絲氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05)；對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊羊水中脯氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、Arg、色氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第90 d，NCG2組母羊羊水中谷氨酰胺、Arg和瓜氨酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組牛黃氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05)，NCG2組和NCG1組鳥氨酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組、NCG1組和NCG2組母羊羊水中半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、組氨酸和本丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，脯氨酸和纈氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 妊娠期第45和90天母羊羊水中氨基酸濃度的變化Table 5 Changes of amino acids concentrations in maternal amniotic fluid at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L

2.5 日糧添加NCG對(duì)妊娠期羊胎兒血漿中氨基酸濃度的影響

由表6可知，妊娠期第90 d，對(duì)照組胎兒血漿中甘氨酸和甲硫氨酸濃度極顯著高于NCG1組和NCG2組(P<0.01)，NCG2組和NCG1組蘇氨酸和鳥氨酸濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，對(duì)照組半胱氨酸和色氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05)，NCG1組丙氨酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NCG2組和NCG1組Arg濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NCG2組瓜氨酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組牛黃氨酸濃度顯著高于NCG2組(P<0.05)、極顯著高于NCG1組(P<0.01)。

表6 妊娠期第90天胎兒血漿中氨基酸濃度的變化Table 6 Changes of amino acids concentrations in fetal plasma at 90 days of pregnancy μmol/L

3 討 論

3.1 日糧添加NCG對(duì)妊娠前期母羊體重、胎兒體重、尿囊液量及羊水量的影響

母體子宮內(nèi)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其過(guò)程中受到營(yíng)養(yǎng)、遺傳、生理、母體成熟和環(huán)境等綜合因素影響的作用[12-13]。母體的自然分娩和新生兒的正常生存需要有一個(gè)“最佳”的母體配種體重和胎兒初生體重[14]。胎兒初生體重在“最佳”范圍之外出現(xiàn)偏差或者波動(dòng)都有可能對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的影響，使胎兒的體尺和組織器官生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)異常變化，可能對(duì)后代的生理和代謝造成永久性的改變，甚至影響新生兒的生存能力，同時(shí)改變后代的健康[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加NCG對(duì)母畜妊娠期的胚胎、胎盤和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[18-19]。劉俊鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠早期胎兒的體重與尿囊液及和羊水量以及生化參數(shù)緊密相關(guān)，尿囊液與羊水量及化學(xué)成分的變化可以反映胎兒-母體間營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的狀況[21]。母畜體內(nèi)尿囊液和羊水中的生化成分是胎兒生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量或活性的變化可反映胎兒組織細(xì)胞通透性與機(jī)體新陳代謝狀況[22]。羊水中的氨基酸(AA)主要源于妊娠前期母體胎盤和胎兒之間的物質(zhì)循環(huán)，尿囊液中的AA主要來(lái)自于母體和胎兒的分泌物[23]。胎兒能過(guò)通過(guò)吞咽羊水獲得自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要的AA和其他生物分子[24]，這些物質(zhì)部分來(lái)自于胎盤，因此羊膜腔內(nèi)的羊水量及成分受到胎兒和胎盤等因素的影響。在本試驗(yàn)中，妊娠前期(0～90 d)日糧添加不同劑量的NCG對(duì)鄂爾多斯細(xì)毛羊母羊體重和胎兒體重沒(méi)有顯著的影響(P>0.05)，而日糧添加不同劑量的NCG在妊娠期45 d和90 d都有增加尿囊液和羊水含量的趨勢(shì)(P>0.05)， 這可能由于日糧中NCG的添加改變了尿囊液和羊水中的物質(zhì)代謝反應(yīng)[20]，尿囊液和羊水量的增加可能對(duì)鄂爾多斯細(xì)毛羊胎兒-母體間營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用。

3.2 日糧添加NCG對(duì)妊娠前期母羊血漿、尿囊液、羊水及胎兒血漿中氨基酸濃度的影響

氨基酸在動(dòng)物妊娠過(guò)程中對(duì)于胎盤和胎兒的發(fā)育具有重要的代謝作用，由AA合成的蛋白質(zhì)是胎兒組織器官的主要組成部分，母體血液AA能夠通過(guò)胎盤運(yùn)輸?shù)教后w內(nèi)以供給胎兒生長(zhǎng)發(fā)育[25]，因此妊娠期母體蛋白質(zhì)的補(bǔ)充是改善胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的有效措施[19]。Arg作為人體和動(dòng)物組織中蛋白質(zhì)最豐富的載體之一，是機(jī)體內(nèi)合成蛋白質(zhì)、一氧化氮(NO)、尿素、多胺、鳥氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺和肌丁胺等多種物質(zhì)的直接或間接前體物質(zhì)[26]。Arg也可以通過(guò)其代謝物調(diào)控下丘腦、腎上腺和胰腺中激素的分泌、胎盤的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸及組織中蛋白質(zhì)的合成等。NCG作為Arg的合成限速酶有效激活劑，可以增強(qiáng)內(nèi)源性Arg的合成。研究發(fā)現(xiàn)，母體補(bǔ)充Arg會(huì)增加子宮-胎盤血流量，有效促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育[15，27]。Arg是哺乳動(dòng)物妊娠期必需的功能性氨基酸，也是合成動(dòng)物機(jī)體內(nèi)多種生物活性分子的前體物質(zhì)[4，28]，在妊娠期母羊日糧中添加功能性氨基酸對(duì)胎兒和胎盤生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要。Thureen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，母體血漿Arg濃度通過(guò)子宮-胎盤樞紐功能的臍帶和血管轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒體內(nèi)，提高胎兒體內(nèi)的Arg濃度，促進(jìn)胎兒器官和組織的生長(zhǎng)發(fā)育。NO是血管舒張和信號(hào)分子，多胺是DNA和蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)控者，作為NO和多胺合成的前體物，Arg能夠能夠調(diào)控胎盤的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，參與組織中蛋白質(zhì)合成等多種生理過(guò)程，對(duì)胎盤和胎兒的發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用[16，19，30]。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠前期(0～90 d)日糧添加不同劑量的NCG顯著增加母羊血漿、尿囊液、羊水及胎兒血漿中Arg、瓜氨酸和鳥氨酸的濃度(P<0.05)，母羊血漿和胎兒血漿中谷氨酸的濃度隨著NCG劑量的增加而增加，母羊尿囊液和羊水中谷氨酰胺的濃度顯著增加(P<0.05)。日糧中添加NCG不僅能夠提高母羊血漿中Arg家族的濃度，還能增加尿囊液、羊水和胎兒血液中Arg家族的濃度，提高機(jī)體內(nèi)源性Arg濃度，促進(jìn)機(jī)體合成肌酸、多胺、NO和激素等重要的生物活性物質(zhì)[31]。這些生物活性物質(zhì)能夠提高母羊卵子質(zhì)量和排卵數(shù)、受精卵的定植和胚胎在子宮內(nèi)附植，促進(jìn)胎盤生成及孕體的生長(zhǎng)發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，Arg使母畜血漿、羊水和尿囊液中精氨酸的濃度顯著提高，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致[20]。尿囊液和羊水中Arg濃度的增加與妊娠前期胎盤合成最大量的NO和多胺有關(guān)，此時(shí)胎盤正在快速生長(zhǎng)，Arg在母畜體內(nèi)經(jīng)NOS分解代謝為NO后，子宮對(duì)Arg以及NO進(jìn)行充分吸收和合成，以滿足胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的需要[13，32-33]。日糧中添加NCG通過(guò)提高母羊自身和胎兒體內(nèi)Arg、瓜氨酸和鳥氨酸濃度，進(jìn)而提高胰島素、生長(zhǎng)激素、胰島素樣-1、甲狀腺素等的分泌，胰島素和生長(zhǎng)激素能夠調(diào)節(jié)肌肉、脂肪和肝臟組織中的糖酵解、TCA循環(huán)、脂肪酸氧化以及糖異生和氨基酸代謝途徑的相互轉(zhuǎn)換和合成[4，15]。在若干個(gè)代謝通路的協(xié)同作用下，妊娠期第10～15天母羊子宮腔內(nèi)Arg濃度將增加8倍[34-36]，子宮腔內(nèi)的Arg會(huì)增加生物活性分子NO和多胺含量，能夠誘導(dǎo)母羊孕體滋養(yǎng)外胚層中的IFNT使胚胎從球形狀改變?yōu)榻z狀結(jié)構(gòu)。體內(nèi)的Arg在Arg脫羧酶(ADC)作用下分解為胍丁胺，胍丁胺在胍丁胺酶(AGAMAT)的作用下形成腐胺，胍丁胺和腐胺是直接影響子宮和孕體發(fā)育的關(guān)鍵活性物質(zhì)。在Arg代謝途徑中，ODC1作為限制性酶抑制Arg的轉(zhuǎn)變多胺途徑，SLC7A1是孕體滋養(yǎng)外胚層最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)Arg的載體，NOS3是母羊孕體滋養(yǎng)外胚層合成NO和瓜氨酸的關(guān)鍵NOS異構(gòu)酶[37]。鳥氨酸是Arg在Arg酶的作用下的代謝產(chǎn)物，作為尿素循環(huán)的一部分與尿素形成有關(guān)。增加的Arg濃度促進(jìn)鳥氨酸濃度升高，在鳥氨酸脫羧酶作用下形成多胺，從而進(jìn)入尿素循環(huán)促進(jìn)氨解毒作用。妊娠前期日糧添加不同劑量的NCG顯著增加母羊尿囊液和胎兒血漿中蘇氨酸的濃度(P<0.05)，母羊血漿和羊水中蘇氨酸的濃度也不同程度表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)(P>0.05)。蘇氨酸屬于生糖氨基酸家族的成員，可以代謝轉(zhuǎn)變成丙酮酸、a-酮戊二酸和草酰乙酸，通過(guò)羧酸變成葡萄糖和糖原。這些AA濃度的增加能夠促進(jìn)新生羔羊糖代謝，從而提高抵抗饑餓和寒冷等外界環(huán)境的能力，有效維持體溫和提高生存能力。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，妊娠前期日糧中添加NCG有效提高母羊血漿、尿囊液、羊水和胎兒血漿中Arg家族氨基酸的濃度，對(duì)保障胎兒早期程序化的健康生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。