馬大川，李 娟，劉秋晨，林 洋，王效禹，單春喬

(大連三儀動物藥品有限公司，遼寧 大連 116000)

目前廣泛應用的益生菌制劑主要為活菌制劑和益生菌發(fā)酵過程中的培養(yǎng)物?；罹苿┛膳c動物體內(nèi)的有害菌競爭生存空間以獲得優(yōu)勢地位，同時所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物被動物利用以增強機體免疫和提高生產(chǎn)性能[1-2]；培養(yǎng)物可以為瘤胃內(nèi)有益微生物提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)進而促進其增殖，其中的活性成分也能直接被動物機體利用。奶牛常見疾病中以微生物感染和代謝相關(guān)疾病居多，通過抗生素治療和調(diào)整飼料結(jié)構(gòu)往往不能迅速治愈[3]，益生菌雖然不能在奶牛的常見疾病控制過程中起到?jīng)Q定性的作用，但是可以明顯減緩病情[4]。本文綜述了益生菌制劑在奶牛子宮內(nèi)膜炎、熱應激、能量負平衡以及瘤胃酸中毒中的應用，旨在為微生態(tài)制劑對奶牛的疾病的發(fā)生和控制方面提供參考。

1 奶牛子宮內(nèi)膜炎

奶牛子宮內(nèi)膜炎多發(fā)生于分娩至產(chǎn)后21 d這段時間內(nèi)，常呈現(xiàn)全身癥狀。表現(xiàn)為體溫超過39.5 ℃、陰道處有紅棕色水狀惡臭分泌物流出、病牛遲鈍、食欲不振、心率升高以及產(chǎn)奶量下降等[5]。Klibs等[6]研究發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生與子宮微生物菌群的失調(diào)有關(guān)。母牛在分娩時子宮受損導致致病菌感染是此病的主要原因。例如大腸桿菌釋放內(nèi)毒素脂多糖可損傷子宮內(nèi)膜細胞，引發(fā)炎癥反應。通?？股刂委?～10 d可使67%～77%的病牛體溫恢復到正常的水平，但是卻不能有效緩解惡臭分泌物的排出，同時奶牛的生殖能力也沒有得到有效改善[7]。除抗生素外，益生菌的使用也能在一定程度上緩解奶牛子宮內(nèi)膜炎。Sandra等[8]將復合乳酸菌菌制劑(鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和羅伊氏乳桿菌以25∶25∶2的比例)灌注病牛子宮，結(jié)果顯著減少了病牛炎癥標志物(IL-8、IL-1β和IL-6)的分泌。大腸桿菌感染子宮內(nèi)膜上皮細胞6 h后就會對其產(chǎn)生明顯的變化，呈現(xiàn)出嚴重的細胞核固縮以及折光率的改變，而經(jīng)過乳酸菌前處理后細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。說明乳酸菌可在一定程度上緩解大腸桿菌對細胞的破壞作用[9]。在對奶牛陰道注入乳酸菌時，盡管乳酸菌沒有到達子宮內(nèi)膜，但是由于乳酸菌的使用改變了陰道環(huán)境，也達到了限制了大量有害菌到達子宮的目的[10]。奶牛在分娩過程中可能伴隨著中性粒細胞吞噬功能受損，導致子宮抗細菌感染能力下降。Genís等[11]使用不同乳酸菌的組合對奶牛子宮內(nèi)膜炎患病率以及中性粒細胞炎癥標志物表達量進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰道治療使子宮炎患病率降低了58%；子宮和陰道治療降低了血液中性粒細胞基因的表達，子宮內(nèi)膜中促炎標記物的表達在子宮和對照奶牛之間差異不顯著。子宮內(nèi)膜作為子宮的第一道防線，可以識別脂多糖，產(chǎn)生促炎性細胞因子來應對大腸桿菌的入侵。硏究證明,奶牛子宮內(nèi)膜細胞能夠通過TLR4下游的MyD88依賴性信號途徑識別脂多糖，進而增加IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA水平的表達。鼠李糖乳桿菌通過衰減MyD88依賴性和非依賴性信號傳遞途徑的信號轉(zhuǎn)導，以及加強NLRs和TLRs之間的相互作用，抑制大腦桿菌誘導的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞NF-kB信號通路的激活，進而減少了炎性細胞因子IL-1β、IL-18、IL-8、TNF-α、IL-6、IL-10和IFNβ的釋放，從而減輕了大腸桿菌誘導的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的炎性損傷作用[9]。

2 奶牛熱應激

熱應激(Heat stress，HS)是奶牛最重要的環(huán)境應激源之一，在全球環(huán)境不斷變化的情況下，HS已經(jīng)嚴重影響到了奶牛的生產(chǎn)性能、繁殖性能，并對奶牛健康產(chǎn)生了嚴重的威脅[12]，其中氣候濕潤的亞熱帶地區(qū)所受的影響將會更大[13]。我國以荷斯坦奶牛為主，其自身散熱性差，產(chǎn)熱大，對HS尤為敏感。炎熱環(huán)境直接導致了奶牛采食量下降，嚴重時可通過破壞瘤胃上皮黏膜完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、影響菌群的定植、降低飼料轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)性能[14]。酵母及培養(yǎng)物具有蛋白含量高、易吸收的特點，并且含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在奶牛HS時可有效緩解由采食量不足引起的營養(yǎng)素缺乏。劉旭日等[15]研究表明，酵母培養(yǎng)物飼喂HS的泌乳早期奶牛可顯著增加其干物質(zhì)采食量并增加產(chǎn)奶量，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率。瘤胃微生物為奶牛提供了70%的能量需求和50%的蛋白質(zhì)需求[16]，HS改變了瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)和豐度，使淀粉和纖維分解菌的豐度降低。酵母培養(yǎng)物可調(diào)節(jié)瘤胃微生物平衡，增加纖維分解菌的數(shù)量和乳酸利用菌數(shù)量，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[17]。

HS可影響奶牛的免疫系統(tǒng)。HS可顯著影響奶牛的先天免疫，使細胞因子表達失調(diào)，甚至誘導免疫抑制，HS也可通過降低血液中的免疫球蛋白含量來影響體液免疫。最近研究表明，HS通過bax/bcl-2途徑誘導奶牛細胞凋亡[18]。酵母細胞壁提取物酵母多糖(yeast polysaccharide，YPS)在調(diào)節(jié)免疫反應和抵抗氧化應激方面具有明顯的作用。同時，YPS還能顯著逆轉(zhuǎn)上述由HS引起的免疫系統(tǒng)變化。其中，YPS通過提高血清中IgG、IgM、IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α含量，以提高奶牛的體液免疫；YPS通過刺激相關(guān)細胞因子的生成，使bcl-2/bax-α比值降低。除此之外，YPS通過誘導TLR2對多種免疫細胞起到保護作用[19]。因此，推測YPS可通過激活TLR2信號來減輕熱應激誘導的免疫抑制。反映在臨床上則表現(xiàn)為酵母多糖顯著提高了奶牛干物質(zhì)攝入量和產(chǎn)奶量，增加血清中IgA、IL-2和TNF-α含量，提高肝臟Bcl-2/bax-α比值[20]。

HS還會影響奶牛的代謝活動。HS使奶牛的紅細胞、血紅蛋白含量的下降，引起奶牛供氧不足；并且隨著應激時間的延長，自由基產(chǎn)生增多，清除緩慢，導致代謝紊亂。于楓等[21]將YPS以10 g/頭/d的劑量飼喂HS下的奶牛，結(jié)果與對照組相比，YPS組產(chǎn)奶量提高了34%，同時血清中離子成分含量、血液紅細胞數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積含量血液也顯著高于對照組，谷胱甘肽過氧化物酶含量也較對照組提高42%。表明YPS提高了HS下奶牛的抗氧化能力，增強了對應激的抵抗力。

3 奶牛能量負平衡

奶牛圍產(chǎn)期產(chǎn)奶高峰早于采食高峰而呈現(xiàn)能量負平衡(Negative energy balance，NEB)，奶牛產(chǎn)生NEB、以及產(chǎn)生NEB后恢復的程度顯著影響了奶牛的生產(chǎn)性能和繁殖性能[22-23]。引起NEB的原因有干物質(zhì)采食量下降、泌乳的增加、血液中非酯化脂肪酸的抑制作用以及揮發(fā)性脂肪酸與瘤胃微生物的種類、數(shù)量比例等[24-25]。除此之外，圍產(chǎn)期奶牛日糧由高粗日糧向高精日糧轉(zhuǎn)換時，丙酸生成菌反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii，M．elsdenii)減少導致了丙酸供給不足是促進NEB的一個重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，將酵母菌與丙酸生成菌進行混合培養(yǎng)可顯著提高丙酸的生成量。酵母菌的生長為丙酸生成菌提供了乳酸、B族維生素、葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，有利于反芻月形單胞菌和M.elsdenii的生長與代謝[26]，將復合酵母菌灌服圍產(chǎn)期奶牛后，瘤胃丙酸生成菌數(shù)量也有顯著提高，揮發(fā)性脂肪酸含量也有所上升。除了影響營養(yǎng)代謝外，NEB還會影響脂肪動員、激素分泌、卵泡發(fā)育、血液代謝，損害奶牛生殖機能，誘發(fā)炎癥[27]。孫光野等[28]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生NEB的奶牛血液中的Ca、Mg水平顯著低于正常水平，同時，IL-1、IL-2、IL-6、HP、CRP、TNF-α的水平卻顯著高于正常值，這便說明了奶牛在發(fā)生NEB時機體產(chǎn)生了嚴重的免疫抑制。釀酒酵母(SC)細胞壁的主要成分有α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖以及幾丁質(zhì)等，能與免疫細胞相互作用，刺激巨噬細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和中性粒細胞發(fā)揮作用，從而提高先天免疫和體液免疫[29-30]。補充SC不僅能增強消化和營養(yǎng)價值，而且還能提高平均每日體重增加、飼料轉(zhuǎn)化率和血液成分，從而提高先天免疫和體液免疫。Punetha等[31]將SC、朊脂和甜味劑混合制成奶牛膳食補充劑飼喂NEB卡蘭-弗里斯(Karan Fries，KF)奶牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，試驗組奶牛的干物質(zhì)采食量有所改善；β-羥基丁酸濃度較低，奶牛能量狀態(tài)有所改善。同時試驗組淋巴細胞增殖明顯高于對照組，導致IL-1β和TNF-α表達增加。高表達的炎性細胞因子表明奶牛處于應激狀態(tài)，α-D-葡聚糖和β-D-葡聚糖是酵母細胞壁的主要成分，它們直接與免疫細胞相互作用，提高了免疫效果[32]。

4 奶牛瘤胃酸中毒

奶牛采食了大量易發(fā)酵的碳水化合物并超過了瘤胃緩沖能力時，瘤胃內(nèi)丙酸等揮發(fā)性脂肪酸和乳酸大量積累，引發(fā)瘤胃酸中毒(rumen acidosis，RA)。當瘤胃pH降到6.0以下，便會出現(xiàn)臨床癥狀[33]。當pH處于5.0～5.5時為亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)，當pH降到5.0以下時為急性瘤胃酸中毒(ARA)。發(fā)生RA時瘤胃內(nèi)乳酸利用菌和生成菌嚴重失衡，導致乳酸大量積累，從而破壞營養(yǎng)物質(zhì)的利用，損害胃腸道微生物群的功能，降低胃腸道上皮細胞的吸收和屏障能力[34]。由于SARA和ARA的pH都很低，大多數(shù)革蘭氏陰性細菌都會發(fā)生分解，從而導致內(nèi)毒素(如脂多糖)釋放到瘤胃液中，引發(fā)全身炎癥[35]。離子載體莫能菌素是由鏈球菌產(chǎn)生的抗菌化合物，對革蘭氏陽性菌有選擇性的抑制作用，使革蘭氏陰性菌得以存活。莫能菌素鈉是預防肉牛ARA最常用的離子載體[36]。Reis等[37]將4×109cfu/只/d的釀酒酵母添加于綿羊日糧中，與33 mg/kg莫能菌素(總干物質(zhì)攝入量)以及對照組比較，對將蔗糖注入瘤胃的綿羊ARA模型來說，釀酒酵母組有效的減少了綿羊瘤胃乳酸的積累，降低了瘤胃滲透壓，明顯好于莫能菌素組的降低瘤胃pH的下降率。M．elsdenii是瘤胃中主要的乳酸利用菌，能夠降低乳酸濃度，使瘤胃pH升高。M．elsdenii在瘤胃中可同時以葡萄糖、麥芽糖和乳酸作為底物。當牛被飼喂以淀粉為主的高精日糧時，M．elsdenii首先利用乳酸，當乳酸的含量極低時才會利用葡萄糖、麥芽糖，這種底物的選擇順序?qū)徑釸A至關(guān)重要[38]。而且，隨著飼喂可溶性糖的增加，M．elsdenii對乳酸的發(fā)酵作用也會增加。M．elsdenii對pH耐受的閾值為5.4，這就保證了在發(fā)生SARA時，瘤胃中大多數(shù)細菌裂解死亡的情況M．elsdenii下仍能大量增殖。牛鏈球菌(Streptococcusbovis，S．bovi)為主要的乳酸生成菌，由于其胞內(nèi)pH能夠隨著胞外pH的變化而變化，因此酸度對于S．bovi的生長影響不大。所以當瘤胃環(huán)境降低到5.0以下時，S．bovis仍能大量利用葡萄糖，迅速增殖，在菌體內(nèi)通過一系列的酶促反應最終生成乳酸[39]。瘤胃接種M．elsdenii可以有效緩解RA[40]，其不僅可以將大量乳酸代謝為揮發(fā)性脂肪酸，而且還能與S．bovis競爭葡萄糖底物，從而限制了乳酸生成[41]。不同來源的M．elsdenii均在一定程度上降低了瘤胃中乳酸濃度[42]，將瘤胃pH維持在了合理的范圍內(nèi)[43]。在添加劑量的選擇上，Kung等[44]發(fā)現(xiàn)在人工瘤胃液中添加8.7×106個/mL的M．elsdenii可使pH始終維持在5.3以上，并且可大量分解乳酸。而6×107個/mL的M．elsdenii407A可顯著降低瘤胃乳酸濃度，提高pH，減輕RA[45]。

5 小 結(jié)

益生菌制劑在應對奶牛常見疾病方面展現(xiàn)出了不錯的應用效果，在目前抗生素使用日益嚴峻的情況下，為牧場應對疾病提供了一個良好的思路。但是益生菌的使用還不能完全起到藥物所帶來的效果，因此也僅僅是能作為輔助手段來緩解疾病的進程。有些慢性疾病在發(fā)生初期癥狀不是十分明顯，持續(xù)的使用益生菌制劑可以起到很好的預防作用。開發(fā)更有針對性的益生菌制劑以及益生菌制劑的重要活性成分會給益生菌的使用帶來更廣闊的空間。同時，對于益生菌的使用應更傾向于日常的保健方面，提升動物的免疫力，增強抗病力、抗應激能力以應對惡劣環(huán)境下動物的健康狀況。結(jié)合科學的牧場管理，合理的飼料配方，從而將動物的疾病發(fā)生控制在最低水平。在益生菌制劑的研發(fā)上，外源添加的益生菌制劑能否與瘤胃內(nèi)微生物之間形成穩(wěn)定的體系，以及其能夠持續(xù)發(fā)揮作用的時間也是值得深入研究的問題。所以，要想在奶牛飼養(yǎng)過程中用好益生菌制劑，還有許多基礎(chǔ)工作需要完成。