蔡?hào)|軒，孫唯夫，金作林，劉 佳

牙周病是最常見的口腔疾病之一，在我國大約有90%的人患有牙周疾病，其中能造成深部牙周組織結(jié)構(gòu)破壞的牙周炎發(fā)病率大于40%，有活動(dòng)性牙周炎的人群比例也在逐年上升[1]。牙周炎造成的牙齒伸長(zhǎng)、咬合創(chuàng)傷等情況會(huì)影響口頜系統(tǒng)功能和顏面美觀，因此而尋求正畸治療的患者越來越多。牙周炎癥未得到有效控制的情況下對(duì)牙周炎患者進(jìn)行正畸治療會(huì)出現(xiàn)牙槽骨的快速吸收，這一情況大幅增加了治療難度和風(fēng)險(xiǎn),因此在正畸治療前以及期間有效控制牙周炎癥是十分必要的[2]。但即便牙周炎癥得到控制，不可逆的牙周附著喪失等情況也會(huì)使得牙周病患者的牙周組織改建再生能力下降，正畸預(yù)后較差，其具體機(jī)制尚不清晰。作為牙周組織間充質(zhì)干細(xì)胞之一的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)因具有高度的增殖、自我更新和多向分化能力[3],自發(fā)現(xiàn)以來就是修復(fù)與再生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]，是參與牙周組織再生的主要候選干細(xì)胞[5]。然而牙周炎微環(huán)境對(duì)PDLSCs的生物學(xué)功能有很大影響，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境下PDLSCs的聚集受到顯著抑制，成骨分化能力和免疫調(diào)節(jié)能力受損，其相應(yīng)標(biāo)記基因ALP、RUNX2、OCN的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牙周炎微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致PDLSCs成骨能力下降，其功能損害無法通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增而恢復(fù)，但改善其所處的微環(huán)境，例如將其與牙囊細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可以恢復(fù)牙周炎環(huán)境下受損的再生能力[8]。因此，改善PDLSCs的炎癥損傷對(duì)牙周組織的改建和再生至關(guān)重要。

正畸治療時(shí)牙齒周圍骨組織吸收與再生的平衡是正畸治療的關(guān)鍵，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10作為重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子參與了骨和牙周膜重塑的過程[9]。與正常情況相比，牙周病組織來源的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells obtained from periodontal tissues of periodontitis patients, PPDLSCs)中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)明顯上升[10]，高表達(dá)的IL-1β通過激活核因子-κB(NF-κB)和有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制PDLSCs的成骨能力[11]。但目前關(guān)于PPDLSCs在牽張力加載情況下炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況仍不清晰，因此本實(shí)驗(yàn)建立不同靜態(tài)牽張力(static mechanical strain, SMS)加載下正常來源的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells obtained from healthy periodontal tissues, HPDLSCs)和PPDLSCs模型，通過Elisa檢測(cè)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平，探明不同SMS加載條件下PPDLSCs的炎癥反應(yīng)情況與HPDLSCs的差異，為臨床上牙周炎患者的正畸治療提供一定的生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶(Sigma，美國)；胎牛血清(四季青公司，中國)；鼠抗人 CD105、CD29、CD14 (Bioscience，美國)；ELISA 檢測(cè)試劑盒(R&D Systems，美國)；Bioplate 6孔板、FX-4000T Tension Plus Unit(Flexcell，美國)；CO2孵箱(Heraeus，德國)；紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；臺(tái)式水平離心機(jī)(Beckman，美國)；流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter，美國)；6 孔培養(yǎng)板(Falcon，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPDLSCs和PPDLSCs的獲取 HPDLSCs來源于10例準(zhǔn)備在空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院正畸科接受正畸治療且牙周組織健康的患者，平均年齡(37.9±7.2)歲，女5例，男5例。PPDLSCs 來源于8例準(zhǔn)備在空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院正畸科接受正畸治療且被診斷為中度慢性牙周炎的患者，平均年齡(38.9±7.9)歲，女4例，男4例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1999年國際研討會(huì)所制定的牙周病分類標(biāo)準(zhǔn)[12]：探診出血陽性，牙周袋深度≤6 mm，附著喪失 3～4 mm，X線片顯示牙槽骨水平吸收達(dá)根長(zhǎng)的 1/3～1/2。上述患者均無系統(tǒng)性疾病、吸煙史和用藥史，因正畸原因拔除前磨牙或第三磨牙。所有患者對(duì)本研究知情同意。

1.2.2 細(xì)胞的原代培養(yǎng)和純化 拔出患者牙齒后，立即放入含雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。使用含雙抗的0.01 mol/L的PBS避開近牙齦側(cè)和根尖部位，反復(fù)沖洗離體患牙至牙根潔凈，刮取根中1/3的牙周膜組織，用細(xì)滴管轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量3 g/L Ⅰ型膠原酶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中每隔5 min震蕩1次，共消化15 min。終止消化反應(yīng)后低速離心機(jī)800 r/min離心5 min，倒掉上清液保留底部沉淀組織。再次加入少許α-MEM，將離心管底部沉淀組織吹打均勻后接種于6孔板上，上蓋無菌蓋玻片以防止組織漂浮，加入少量α-MEM培養(yǎng)液覆蓋6孔板底層，將6孔板置于恒溫37 ℃ CO2孵箱，3天換培養(yǎng)液1次，約14 d細(xì)胞在六孔板底達(dá)到80%匯合。25 g/L胰蛋白酶1 mL孵箱內(nèi)消化2 min，鏡下觀察細(xì)胞脫離貼壁呈球狀后加入等量含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM中和胰蛋白酶消化反應(yīng)，細(xì)滴管反復(fù)吹打六孔板底壁至所有細(xì)胞脫離貼壁，將含細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中以800 r/min離心8 min，棄掉上清液后加入α-MEM制備單細(xì)胞懸液，以每瓶1 000個(gè)的密度將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中。10 d左右，低密度接種的細(xì)胞形成克隆團(tuán)塊，將不同患者來源的多克隆細(xì)胞消化混合后傳至第3代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物 取上步實(shí)驗(yàn)所得第3代HPDLSCs和PPDLSCs，加入PBS沖洗，胰蛋白酶消化后，低速離心機(jī)中800 r/min離心5 min，保留管底沉淀，加入適量培養(yǎng)液吹打均勻。調(diào)整細(xì)胞密度為每200μL 5×105個(gè)，分別加入2 μL鼠抗人CD105、CD29、CD14抗體，4 ℃條件下避光孵育1 h，用含30 mL/L胎牛血清的PBS沖洗3遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD分子的表達(dá)情況。

1.2.4 茜素紅染色檢查成骨分化能力 取第3代HPDLSCs及PPDLSCs，胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，六孔板每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%匯合后，更換為含10% FBS的α-MEM，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L，維生素C 50 mg/L，地塞米松100 nmol/L的成骨誘導(dǎo)液，每3 d更換1次成骨誘導(dǎo)液。21 d后棄掉成骨誘導(dǎo)液，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，使用PBS洗凈，加入茜素紅染液，放置于37 ℃孵箱內(nèi)30 min，吸棄染液，PBS沖洗2遍，顯微鏡下拍照。

1.2.5 構(gòu)建SMS加載裝置 取第3代HPDLSCs及PPDLSCs，制備單細(xì)胞懸液，以每孔3×105個(gè)的密度接種于Bioflex 6孔板，無血清饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞同步化，24 h后更換10% FBS α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，運(yùn)行FX-4000T軟件，設(shè)置頻率為0.1 Hz，力的種類為靜態(tài)牽張力(static mechanical strain，SMS)，力值分別為 6%、8%、10%、12%和14%，加力時(shí)間為12 h[13-14]。對(duì)照組HPDLSCs及PPDLSCs以同樣密度接種于Bioflex 6孔板后不加力，放置于孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)12 h，收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HPDLSCs及PPDLSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Elisa檢測(cè)炎性細(xì)胞因子分泌水平 吸棄上步實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞的原培養(yǎng)液，每孔加入2 mL新鮮的α-MEM培養(yǎng)液，靜置24 h后收集上清液；設(shè)置8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；每孔按操作次序分別加入100 μL待檢測(cè)樣品，50 μL第一抗體，100 μL酶標(biāo)抗體，100 μL底物液，50 μL終止液后，用分光光度儀在450 nm處檢測(cè)各孔吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，兩對(duì)照組間比較，使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，加力組及對(duì)照組各組間比較，使用One-way ANOVA及Bonferroni post hoc test檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPDLSCs 及 PPDLSCs 形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察多克隆來源的 PDLSCs，均呈間充質(zhì)干細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，漩渦狀密集排列，肉眼觀察HPDLSCs組和PPDLSCs組形態(tài)上無明顯差異(圖1)。

A:第3代HPDLSCs；B: 第3代PPDLSCs

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物

HPDLSCs組和PPDLSCs組均強(qiáng)陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105和CD29，而造血系標(biāo)記物CD14則呈陰性表達(dá)。此外，強(qiáng)陽性表達(dá)標(biāo)記物CD105和CD29在HPDLSCs組中的表達(dá)比率均顯著高于PPDLSCs組(圖2)。

A: HPDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)情況；B: PPDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)情況

2.3 HPDLSCs 和 PPDLSCs成骨能力鑒定

21 d成骨誘導(dǎo)后鏡下觀察顯示PDLSCs呈復(fù)層生長(zhǎng)，并形成散在紅色礦化結(jié)節(jié)。HPDLSCs組中礦化結(jié)節(jié)多且面積大，染色較深；PPDLSCs組中礦化結(jié)節(jié)面積小且分散，染色較淺(圖3)。

A: HPDLSCs茜素紅染色情況；B: PPDLSCs茜素紅染色情況

2.4 Elisa檢測(cè)炎性細(xì)胞因子分泌情況

PPDLSCs組中4種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平均高于HPDLSCs組(P<0.05)(圖4)。牽張力加載后，HPDLSCs和PPDLSCs組中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平略有升高，但不同力值組間炎性細(xì)胞因子的表達(dá)無明顯差異(P<0.05)(圖4A、B)；而 IL-6和IL-8 的表達(dá)水平在牽張力加載后發(fā)生了大幅上調(diào)(P<0.05)(圖4C、D)，增加倍數(shù)達(dá)數(shù)百倍。同時(shí)在HPDLSCs 組，當(dāng)力值低于12%時(shí)，加力組各組間IL-6和IL-8的表達(dá)水平無明顯差異，但當(dāng)力值高于12%時(shí)，IL-6和IL-8的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)(圖4)；而在 PPDLSCs 組，6%和8%的牽張力值對(duì)IL-6和IL-8表達(dá)水平的影響基本無區(qū)別，但當(dāng)力值大于8%，IL-6和IL-8的表達(dá)水平會(huì)隨著力值的增大而提升(P<0.05)(圖4C、D)。

A: IL-1β的分泌水平；B: TNF-α的分泌水平；C: IL-6的分泌水平；D: IL-8的分泌水平；*: P<0.05

3 討 論

臨床上牙周炎的分級(jí)有輕度、中度和重度[15]。輕度牙周炎患者炎癥表現(xiàn)不明顯，不利于HPDLSCs和PPDLSCs 的生物學(xué)差異分析，而重度牙周炎患者因嚴(yán)重的牙槽骨吸收和附著喪失，牙周膜所剩無幾，很難獲得PDLSCs，因此我們選擇中度牙周炎患者作為PPDLSCs供體。已有研究表明供體年齡也會(huì)影響PDLSCs的生物學(xué)特性[16]，為了控制年齡因素對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響，對(duì)PDLSCs供體的年齡進(jìn)行篩選，確保兩組年齡間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

以往文獻(xiàn)中常采用力值為12%的SMS對(duì)PDLSCs進(jìn)行機(jī)械刺激[17-18]?？紤]到臨床上牙周病患者對(duì)于正畸力較健康患者更加敏感，力值偏大經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致牙周組織的快速吸收，本研究中假設(shè)受到牙周病微環(huán)境損害的PPDLSCs，對(duì)SMS較HPDLSCs更為敏感。同時(shí)為了觀察HPDLSCs 和PPDLSCs在較小力值和過大力值時(shí)的反應(yīng)，故圍繞12%構(gòu)建了力值為6%、8%、10%、12%、14%的SMS加載系統(tǒng)。

間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)強(qiáng)度在一定程度上表明間充質(zhì)干細(xì)胞干性的強(qiáng)弱[19]。HPDLSCs和 PPDLSCs組中 CD109、 CD29 均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，說明細(xì)胞來源正確。定量分析顯示， CD109、CD29 這兩種標(biāo)記物在 HPDLSCs組中的表達(dá)程度均高于 PPLDSCs組，這一結(jié)果可能與間充質(zhì)干細(xì)胞干性受到炎癥微環(huán)境損傷有關(guān)[20]。茜素紅染色檢驗(yàn)HPDLSCs和PPDLSCs成骨分化能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持這一推論。

正畸牙齒的移動(dòng)依賴于牙周組織吸收與形成的平衡，力加載作用下牙周組織中體液重新分布并出現(xiàn)局部缺氧的情況，進(jìn)而引發(fā)無菌性的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致壓力區(qū)破骨細(xì)胞的激活和張力區(qū)成骨細(xì)胞的聚集。同時(shí)正畸治療下的牙周組織改建也取決于牙周組織中的MSC正常發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[21]。文獻(xiàn)表明牙周組織長(zhǎng)期處于炎癥微環(huán)境中，正常成骨破骨平衡很容易被打破，具體表現(xiàn)為成骨能力下降[22-23]而破骨能力增加[24]，導(dǎo)致牙周組織喪失。炎性細(xì)胞因子過多的分泌會(huì)導(dǎo)致牙周組織的損害，因此為了更好的牙周改建效果應(yīng)該最大程度地保持炎性細(xì)胞因子的分泌平衡，本研究從這一角度切入，重點(diǎn)關(guān)注 SMS 對(duì) HPDLSCs 和 PPDLSCs 炎性細(xì)胞因子分泌的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)HPDLSCs 施加的力值不宜大于 12%，對(duì) PPDLSCs 而言，牙周病的炎癥微環(huán)境使其細(xì)胞功能受損，對(duì)SMS的耐受性明顯低于HPDLSCs，若對(duì)其施加和HPDLSCs同等的力值，則會(huì)導(dǎo)致更多炎性細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步抑制其成骨能力，激活其破骨能力。本研究還發(fā)現(xiàn)不同的炎性細(xì)胞因子對(duì)SMS的敏感性有差異，不同級(jí)別SMS加載下，IL-1β和TNF-α的分泌量略有增加，且各組間無明顯差異，然而IL-6和IL-8的分泌量上調(diào)程度最高可達(dá)數(shù)百倍。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們猜測(cè)這兩種炎性細(xì)胞因子很可能在正畸力介導(dǎo)下牙周組織改建的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)牽張力加載下PPDLSCs中炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的分泌水平相比HPDLSCs更高，其中不同力值組間IL-6和IL-8的分泌水平有較大差異，當(dāng)力值大于8%時(shí)，IL-6和IL-8的分泌水平會(huì)隨著力值的增大而提升。此發(fā)現(xiàn)為臨床上牙周炎患者對(duì)正畸力較健康患者更敏感，更容易出現(xiàn)牙周組織快速吸收，提供一定的理論依據(jù)，對(duì)于牙周炎患者進(jìn)行正畸治療時(shí)，要慎重選擇適宜的力值，必要時(shí)可以縮短牙周炎患者的回訪時(shí)間，及時(shí)地評(píng)估患者的牙周狀況，以便隨時(shí)更改治療計(jì)劃，防止牙周組織出現(xiàn)不可逆的破壞。