楊 婷，陶 碩，張 旗

活髓保存是臨床上牙體牙髓病治療的首要目標，主要通過促進牙本橋形成，隔絕外界刺激，進而使牙齒繼續(xù)行使其各項生理功能[1]，牙髓的自我損傷修復能力是其生物學基礎(chǔ)。但最新研究表明[2-3]，糖尿病可以引起牙髓組織損傷修復受損，在糖尿病大鼠直接蓋髓實驗中，成功率僅有53.8%，臨床研究1年成功率僅有38.2%，這主要是由于糖尿病的氧化應激病理狀態(tài)導致牙髓干細胞發(fā)生氧化損傷[4-5]，增殖、分化等生物學性能減弱，而牙髓組織損傷的成功修復主要依賴于牙髓干細胞增殖、遷移和分化這些生物學性能的有效發(fā)揮[6]。

消退素E1(resolvin E1,RvE1)是近年來廣泛研究的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，由ω-3多不飽和脂肪酸衍生而來[7]，可以通過促進過氧化物的清除和減少自由基的形成來發(fā)揮抗氧化作用[8-9]，同時其還具有抗炎促消退、促進成骨、緩解疼痛、抗纖維化等生物學作用[10-12]。但RvE1能否對氧化應激下人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)的生物學性能起保護作用仍不清楚，因此本研究旨在探索RvE1對氧化應激損傷的hDPSCs形態(tài)、增殖、遷移及成牙向分化這些生物學性能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗、PBS、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)，胎牛血清(Excell Bio，澳大利亞)，Ⅰ型膠原酶、分散酶、DAPI、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗環(huán)血酸(Sigma，美國)，RvE1(Cayman Chemical，美國)，ChemR23抗體(Abcam，美國)，HE染色試劑盒(威奧生物科技有限公司，上海)，鬼筆環(huán)肽(Invitrogen，美國)，4%多聚甲醛(PFA)(聯(lián)超生物科技有限公司，上海)，cck-8檢測試劑盒(同仁，日本)，3%過氧化氫、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(青牧生物科技有限公司，上海)。

1.2 方法

1.2.1 hDPSCs體外分離培養(yǎng)與鑒定 取新鮮拔除、健康的第三恒磨牙(選擇同濟大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科患者，患者知情同意)，用含有10%雙抗的PBS清洗牙齒3次，骨鑿劈開牙冠，暴露牙髓，無菌鑷子取出牙髓組織用含10%雙抗的PBS沖洗3次，將牙髓組織轉(zhuǎn)移至含有3 g/L Ⅰ型膠原酶和4 g/L分散酶的1.5 mL EP管中，無菌眼科剪將牙髓組織剪碎，置于37 ℃培養(yǎng)箱消化1 h，1 200 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀鋪于25 mm2的培養(yǎng)瓶中，4 h后加入含10%FBS和1%雙抗的培養(yǎng)液。每3 d換1次液，待細胞長至80%～90%時進行消化傳代，運用有限元稀釋法分離出牙髓干細胞并通過流式細胞術(shù)及成骨和成脂向誘導進行鑒定，繼續(xù)培養(yǎng)，第3代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 免疫熒光染色檢測ChemR23表達 4%PFA固定hDPSCs 20 min，0.1%Triton-100通透細胞膜10 min，1∶300的比例孵育ChemR23抗體，4 ℃過夜，孵育熒光二抗，DAPI復染，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 cck-8檢測消退素E1最佳作用濃度 將hDPSCs按3×103/孔的密度接種于96孔板，分別加入濃度為1、10、50、100、200 nmol/L的消退素E1，每組設5個復孔，分別于1、3、5、7 d后棄培養(yǎng)液用PBS清洗，按cck-8溶液∶培養(yǎng)基為1∶10的比例每孔加入100 μL的混合液，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長每孔的光密度(OD)值。

1.2.4 HE染色和鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞形態(tài) 將hDPSCs按5×103個/孔的密度接種于24孔板中，實驗分對照組、H2O2組和H2O2+RvE1組3組，每組設2個復孔，H2O2組和H2O2+RvE1組分別加入200 nmol/L H2O2預處理建立氧化應激模型，24 h后，對照組和H2O2組使用含10%血清和1%雙抗的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)， H2O2+RvE1組則使用加入100 nmol/L RvE1的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后，4%PFA固定20 min，按試劑盒說明進行HE和鬼筆環(huán)肽染色，顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 cck-8檢測細胞增殖能力 將hDPSCs按3×103個/孔的密度接種于96孔板，按1.2.3分組，每組設5個復孔，同1.2.3處理，分別于0、1、4和7 d后棄培養(yǎng)液用PBS清洗，按cck-8溶液∶培養(yǎng)基為1∶10的比例每孔加入100 μL的混合液，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長每孔的光密度(OD)值。

1.2.6 劃痕檢測細胞遷移能力 將hDPSCs按2×105個/孔的密度接種于背面劃有橫線6孔板，按1.2.3分組，H2O2預處理24 h后，用1 000 μL的槍頭垂直6孔板背面直線劃豎線，用PBS洗去脫落細胞，對照組和H2O2組加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，H2O2+RvE1組培養(yǎng)基中加入100 nmol/L RvE1，按0、12、24 h時間點取樣拍照。

1.2.7 ALP染色檢測細胞成牙向分化能力 將hDPSCs按5×103個/孔的密度接種于24孔板中，按1.2.3分組，H2O2預處理24 h后，對照組和H2O2組更換為加入含有1×10-8mol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸的礦化誘導液，H2O2+RvE1組則使用加入100 nmol/L RvE1的礦化誘導液，7 d后取樣，首先4%PFA固定20 min,PBS洗3次，加入配置好的ALP染液，避光孵育4 h，去離子水洗，顯微鏡下觀察、拍照，同時，根據(jù)ALP活性檢測試劑盒說明進行各組細胞ALP活性檢測。

1.2.8 RT-qPCR檢測細胞成牙向分化能力 將hDPSCs按1×104個/孔的密度接種于6孔板中，按1.2.3分組，H2O2預處理24 h后，對照組和H2O2組更換為礦化誘導液，H2O2+RvE1組則使用加入100 nmol/L RvE1的礦化誘導液，7 d后取樣,提取細胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄，最后進行RT-qPCR實驗檢測各組細胞DMP1和DSPP基因表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

Graph Pad Prism 7統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析并繪圖，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs鑒定結(jié)果

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示牙髓干細胞表面CD105、CD146、CD90的陽性率分別是92.7%、91.6%、87.3%；CD34、CD45的陽性率分別是0.089%、0.069%，證明實驗所分離培養(yǎng)的hDPSCs是間充質(zhì)組織來源，而非造血細胞來源。hDPSCs成骨向誘導14 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示有大量紅褐色結(jié)節(jié)形成，大小不等；hDPSCs成脂向誘導21 d后，油紅O染色結(jié)果顯示部分細胞內(nèi)有橘紅色脂滴形成，證明我們分離提取的hDPSCs具有成骨向及成脂向分化的潛能(圖1)。

a： hDPSCs表面抗原流式分析結(jié)果；b：hDPSCs成骨向誘導分化結(jié)果；c：hDPSCs成脂向誘導分化結(jié)果

2.2 ChemR23在hDPSCs中的表達

免疫熒光染色結(jié)果顯示，ChemR23在hDPSCs胞質(zhì)中廣泛表達，說明hDPSCs上有RvE1的作用位點(圖2)。

a：ChemR23表達；b：DAPI表達；c：ChemR23和DAPI合成圖

2.3 消退素E1的最佳作用濃度

cck-8結(jié)果顯示，在第5天和第7天的時候，10、100 nmol/L都可以促進牙髓干細胞增殖(P<0.05)，在第7天時100 nmol/L的作用效果比10 nmol/L更強，因此選用100 nmol/L作為作用于牙髓干細胞最適宜的濃度(圖3)。

*：P<0.05；**：P<0.01

2.4 各組hDPSCs形態(tài)學觀察

HE染色結(jié)果顯示，對照組細胞形態(tài)呈典型的紡錘形或長梭形，貼壁好；而H2O2組細胞體積增大，失去原有的紡錘形形態(tài)，且細胞數(shù)目明顯較對照組少；H2O2+RvE1組細胞變形程度輕于H2O2組，并且細胞數(shù)目較H2O2組多，但少于正常對照組。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組細胞見不到清晰的肌動蛋白纖維，細胞內(nèi)部失去清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而H2O2+RvE1組細胞內(nèi)部逐漸清晰，可見肌動蛋白纖維成網(wǎng)狀排列(圖4)。

2.5 各組hDPSCs增殖活性

cck-8檢測結(jié)果可見hDPSCs經(jīng)H2O2處理后，OD值顯著下降，在第1天時比正常對照組降低31.2%(P<0.001)；H2O2處理后給予RvE1處理，與H2O2組比較OD值明顯增加(P<0.05)，但是仍低于正常對照組，并且在第4天和第7天呈現(xiàn)相同的趨勢(圖5)。

a、b、c分別表示對照組、H2O2組、H2O2+RvE1組HE染色結(jié)果；d、e、f分別表示對照組、H2O2組、H2O2+RvE1組鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果

ns：P>0.05；**:P<0.01；****:P<0.000 1

2.6 各組hDPSCs遷移能力

劃痕實驗結(jié)果顯示，在12 h和24 h時，H2O2組細胞遷移面積在12 h和24 h比對照組分別少了26.4%(P<0.001)和37.5%(P<0.001)，而H2O2+RvE1組與H2O2組相比，細胞遷移面積分別在12 h和24 h增加了10.4%(P<0.001)和27.8%(P<0.001)，但仍少于正常對照組(圖6)。

2.7 各組hDPSCs成牙向分化能力

第7天的ALP染色結(jié)果顯示，H2O2組細胞ALP陽性表達明顯弱于正常對照組，而與H2O2組相比，H2O2+RvE1組細胞ALP陽性表達明顯增強；對細胞染色結(jié)果通過Image J軟件進行了半定量分析，結(jié)果顯示，H2O2組細胞ALP陽性表達面積比對照組約低了24.0%(P<0.001)，RvE1對過氧化氫誘導的hDPSCs氧化損傷起到了一定的挽救作用，使ALP陽性表達增加了11.5%(P<0.001)(圖7)。

第7天的RT-qPCR結(jié)果顯示，H2O2組細胞DMP1和DSPP基因表達水平明顯低于正常對照組，而與H2O2組相比，H2O2+RvE1組細胞DMP1和DSPP基因表達水平明顯升高(P>0.05)(圖8)。

*:P<0.05；***:P<0.001；****:P<0.000 1；a、c、e分別表示對照組、H2O2組、H2O2+RvE1組在第7天ALP染色結(jié)果；b、d、f分別表示圖a、圖c、圖e在24孔板中的全景圖；g表示ALP染色的半定量結(jié)果；h表示各組細胞在第7天的ALP活性

3 討 論

目前，體外分離培養(yǎng)人牙髓干細胞可作為研究牙髓干細胞生物學性能的經(jīng)典模型。本研究通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原標志物及多向分化誘導進行鑒定，結(jié)果顯示實驗所分離培養(yǎng)的細胞是間充質(zhì)組織來源，而非造血細胞來源。另外，我們對其成糖尿病宿主的氧化應激病理狀態(tài)主要是活性氧在體內(nèi)積聚過多導致的[13]，H2O2是主要的活性氧之一，作為一種活性小分子，H2O2易于透過各種生物膜進入細胞內(nèi)，發(fā)生反應并生成高活性的自由基，引發(fā)氧化應激[14]，是糖尿病研究領(lǐng)域建立體外細胞氧化應激模型的經(jīng)典刺激源[15]。高濃度(>300 μmol/L)的H2O2通過增加DNA碎片來降低細胞的存活率;而低濃度(100、200 μmol/L)的H2O2通過暫停細胞周期發(fā)揮調(diào)控作用，當H2O2濃度達到400 μmol/L時引起細胞死亡[16]。因此，本實驗選用200 μmol/L H2O2處理來構(gòu)建牙髓干細胞氧化應激微環(huán)境。研究結(jié)果也表明，H2O2誘導的氧化應激會導致hDPSCs氧化損傷，不僅表現(xiàn)在細胞會失去原有的細胞形態(tài)，其增殖、遷移和成牙向分化的能力也受到明顯的抑制，這與Soares等報道[17]一致。

*:P<0.05;**:P<0.01；***:P<0.000 1；****:P<0.000 1；a：各組細胞在第7天DMP1的基因表達水平；b：各組細胞在第7天DSPP的基因表達水平骨及成脂向分化潛能進行了研究，在成骨誘導14 d后進行茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)有礦化結(jié)節(jié)形成，在成脂誘導21 d后，發(fā)現(xiàn)有脂滴形成，證明了我們提取的細胞是人牙髓干細胞。

RvE1是多不飽和脂肪酸衍生而來的新型抗炎促消退介質(zhì)，具有抗炎促消退、促進成骨等多重作用[18]，其抗氧化性是本實驗研究的重點。結(jié)果表明，RvE1不僅可以恢復遷移及成牙向分化，對H2O2誘導的hDPSCs氧化損傷起保護作用。RvE1主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學作用，其作用受體包括趨化樣因子受體1(ChemR23)和白三烯B4受體1(BLT1)[19]，單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞、肺成纖維細胞、脂肪細胞等基質(zhì)細胞中均可見RvE1受體的表達，已有學者證實RvE1受體在牙髓成纖維細胞上也有表達[20]，但是其在hDPSCs上的表達情況尚不清楚。因此，本研究首先檢測了hDPSCs上RvE1受體的表達情況，結(jié)果顯示ChemR23在其胞質(zhì)內(nèi)廣泛表達，表明hDPSCs上存在RvE1的作用位點。鑒于上述實驗結(jié)果，我們進一步探究RvE1對氧化損傷的hDPSCs形態(tài)學改變的作用，結(jié)果顯示，加入RvE1的hDPSCs形態(tài)正常，數(shù)目增多，逐漸恢復其細胞內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Hasturk等[21]證實，RvE1可以促進牙周膜干細胞、心肌干細胞等多種間充質(zhì)干細胞的增殖，但關(guān)于其對hDPSCs作用尤其是氧化損傷的hDPSCs的作用尚罕見報道。本實驗首次證實了RvE1可以促進氧化損傷的hDPSCs的增殖能力，因此推測H2O2組細胞數(shù)目相較于H2O2+RvE1組較少的原因可能是后者hDPSCs增殖能力增強的緣故，但不排除RvE1可能抑制了hDPSCs的部分凋亡，這需要進一步的實驗證明。

綜上所述，我們的研究結(jié)果為氧化應激導致的hDPSCs增殖、遷移及成牙向分化能力下降提供依據(jù)，并為RvE1在氧化應激病理狀態(tài)疾病下活髓保存成為有潛力的治療應用提供支持。因此，在臨床接診患有糖尿病這類氧化應激病理狀態(tài)疾病患者時，應該更注意其牙髓狀態(tài)的判斷，并在診療過程中采取更合適的手段。