喬燕莎， 王 茜， 李 彥,3， 桑佳雯， 王 璐,3

(1. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620； 2. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620；3. 東華大學(xué) 紡織行業(yè)生物醫(yī)用紡織材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620)

疝氣是指人體內(nèi)組織或器官離開正常的解剖位置，通過先天或后天形成的薄弱點(diǎn)、缺損或孔隙進(jìn)入另一部位的疾病。其中，以腹壁疝最為普遍且高發(fā)[1]。目前治療疝氣的主流方法是用疝修補(bǔ)片加固疝缺口的無張力疝修補(bǔ)術(shù)[2]。由經(jīng)編工藝制備的聚丙烯(PP)補(bǔ)片，因輕質(zhì)柔韌，順應(yīng)性好，成為臨床最常用的疝修補(bǔ)片，但植入人體后會引發(fā)炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致補(bǔ)片的過度纖維化，形成硬厚皺縮纖維囊，造成粘連、慢性疼痛、感染等多種并發(fā)癥甚至復(fù)發(fā)，其中約三分之一患者受到慢性疼痛的困擾[3-4]。

PP補(bǔ)片的使用可追溯至20世紀(jì)80年代，目前國內(nèi)關(guān)于降低其炎性反應(yīng)的研究非常少，有研究[5]用脂肪干細(xì)胞覆膜PP補(bǔ)片。而國外研究的抑炎涂層多采用脫細(xì)胞外基質(zhì)[6]或細(xì)胞外蛋白，如膠原[7]、血漿蛋白[8]等。上述采用細(xì)胞或細(xì)胞外成分的方法均存在價格昂貴，工藝復(fù)雜和潛在免疫原性的問題，而膠原甚至?xí)l(fā)更強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)[7]，這些都限制了其實(shí)際應(yīng)用。

近年來，受貽貝黏附蛋白的啟發(fā)，一種將多巴胺在水溶液中發(fā)生氧化自聚合，進(jìn)而通過非共價鍵力附著在材料表面形成穩(wěn)定涂層的方法受到了廣泛的關(guān)注。多巴胺(3, 4雙羥基-L-苯基丙氨酸)是一種典型的兒茶酚衍生物。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究證實(shí)多巴胺自聚合的發(fā)生條件溫和簡單且無毒，所形成的聚多巴胺(polydopamine，PDA)具有黏性強(qiáng)、生物相容性好、穩(wěn)定性佳，目前已被成功應(yīng)用于生物材料的表面改性[9]。最新研究表明，PDA結(jié)構(gòu)鏈段中所具有的多酚結(jié)構(gòu)[10]還具有活性氧清除效應(yīng)，制成的納米顆粒藥展現(xiàn)出了較好的抑炎效果[11]。

綜上，本文擬在PP補(bǔ)片表面通過多巴胺氧化自聚合有效構(gòu)筑無毒性、強(qiáng)附著、抗氧化的PDA涂層，選取小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)和小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)作為炎性應(yīng)答標(biāo)志，探究以PDA降低PP補(bǔ)片炎性反應(yīng)策略的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

聚丙烯(PP)補(bǔ)片(常州市潤源醫(yī)療用品科技有限公司提供)，聚丙烯平膜(實(shí)驗(yàn)室自制)，丙酮、三羥甲基氨基甲烷(Tris，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸緩沖液干粉(PBS，索萊寶科技有限公司)，鹽酸多巴胺(西格瑪有限公司)，小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)和小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8，上海翊圣生物科技有限公司)。

Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀、Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)、Escalab 250Xi型X射線光電子能譜儀(XPS)，美國賽默飛公司；FlexSEM 1000型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本日立公司；OCA15EC型水接觸角測量儀，德國數(shù)據(jù)物理公司；YG (B) 026G-500型電子織物強(qiáng)力儀，大榮紡織儀器有限公司。

1.2 聚多巴胺涂層聚丙烯補(bǔ)片的制備

先后采用丙酮和去離子水，分別對PP補(bǔ)片超聲清洗15 min，隨即晾干后使用。

配制Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH=8.5)，將2 g/L的多巴胺溶解其中。隨后將PP浸漬其中，在37 ℃，60 r/min 的恒溫?fù)u床中反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，超聲清洗2 min，洗去黏附不牢的PDA，再用去離子水漂洗3遍，所得聚多巴胺涂層聚丙烯補(bǔ)片樣品標(biāo)記為PDA-PP。

1.3 性能測試與表征

1.3.1 微觀形貌表征

將PP和PDA-PP噴金處理后在掃描電鏡下觀察補(bǔ)片中單絲表面涂層的微觀形貌。

1.3.2 表面成分測試

將PP和PDA-PP進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜和X射線光電子能譜掃描，分析樣品表面化學(xué)基團(tuán)和元素類別與分布。前者掃描范圍為4000～400 cm-1，后者掃描范圍為0～700 eV。

1.3.3 水接觸角測試

水接觸角可反映PDA涂層對PP材料表面親疏水性的影響。因補(bǔ)片具有孔狀結(jié)構(gòu)，水滴不易聚集在某一區(qū)域，故測試在PP平膜上進(jìn)行。PP平膜的預(yù)處理和涂層制備過程均與PP補(bǔ)片相同。水滴接觸表面10 s后穩(wěn)定拍攝。每種樣品采集5個區(qū)域，計(jì)算平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.3.4 涂層穩(wěn)定性測試

通過降解實(shí)驗(yàn)探究PDA涂層穩(wěn)定性。將PDA-PP放入37 ℃ 的PBS(pH=7.4)溶液中靜態(tài)培育，全程無菌操作。第1、3 天時取出，洗凈凍干噴金后在掃描電鏡下觀察涂層變化。

1.3.5 力學(xué)性能測試

參照ASTM D5035—2011《紡織品斷裂強(qiáng)力及伸長率測試(條樣法)》，將PP和PDA-PP分別沿縱橫向裁剪成25 mm×75 mm的試樣，采用電子織物強(qiáng)力儀進(jìn)行單向拉伸實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：隔距50 mm，拉伸速度300 mm/min。每個方向重復(fù)測試5次。

1.3.6 體外抗氧化性評估

采用總抗氧化能力檢測試劑盒測試PDA-PP的抗氧化性。將樣品裁剪成直徑為14 mm的圓片，每種樣品設(shè)置3個平行樣，放入24孔板中。每孔加入180 μL的FRAP工作液，37 ℃水浴鍋中孵育5 min，用酶標(biāo)儀在593 nm下讀取吸光度。為模擬PDA在體內(nèi)的抗氧化性變化，將PDA-PP靜態(tài)浸泡于37 ℃的PBS(pH=7.4)溶液中，24 h后再測。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞毒性

為驗(yàn)證PDA的生物相容性和排除PDA對后續(xù)巨噬細(xì)胞的毒性影響，采用小鼠成纖維細(xì)胞(L929)與PDA-PP共培養(yǎng)。具體做法是：將L929以每孔1×104個種植在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，穩(wěn)定貼附后，加入滅菌的PP和PDA-PP，并設(shè)置空白對照(BC)樣本。培養(yǎng)24 h后，向24孔板中加入CCK-8染液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后，在酶標(biāo)儀下讀取450 nm波長下的吸光度。每種樣品設(shè)置3個平行樣。相對細(xì)胞活力的計(jì)算公式為

相對細(xì)胞活力=(樣品吸光度/空白吸光度)×100%

細(xì)胞活力越高，樣品毒性越低， 80%以上可認(rèn)為無細(xì)胞毒性。

1.4.2 體外炎性反應(yīng)

將滅菌的PP和PDA-PP放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并設(shè)置空白對照樣本。每孔加入2×104個小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，培養(yǎng)24 h后收集上清液。采用ELISA試劑盒檢測上清液中TNF-α和IL-6的濃度，每種樣品設(shè)置3個平行樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚多巴胺涂層的微觀形貌

圖1為光學(xué)顯微鏡下PP補(bǔ)片的表觀形態(tài)照片。圖2為反映單絲表面微觀形貌的掃描電鏡(SEM)照片?？煽闯觯c表面光滑的PP單絲相比，PDA涂層后的補(bǔ)片表面被大量微納米級尺寸的顆粒所覆蓋，與文獻(xiàn)[12]報道的現(xiàn)象基本相同，初步證實(shí)PDA涂層已沉積于PP補(bǔ)片表面。

圖1 PP補(bǔ)片的表觀形態(tài)照片(×10)Fig.1 Apparent morphology of PP mesh (×10)

圖2 PP和PDA-PP單絲的SEM照片(×3 000)Fig.2 SEM images of PP (a) and PDA-PP(b) (×3 000)

2.2 表面理化性能分析

圖3 PP 和PDA-PP的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PP and PDA-PP

圖4 PDA-PP的X射線光電子能譜圖Fig.4 XPS spectra of PDA-PP

PDA涂層所引發(fā)的表面化學(xué)基團(tuán)的變化也使得PP補(bǔ)片的表面潤濕性相應(yīng)發(fā)生了變化。眾所周知，PP是一種典型的疏水性材料，其水接觸角為101°。PDA涂層后，PDA-PP水接觸角測得為69°，證實(shí)經(jīng)PDA處理后的PP補(bǔ)片材料，其疏水性表面成功演變?yōu)榱擞H水性表面，主要?dú)w因于PDA結(jié)構(gòu)中分布的多種親水性基團(tuán)(—NH和—OH)。

2.3 涂層穩(wěn)定性分析

涂層穩(wěn)定性可保證其在體內(nèi)發(fā)揮作用，由降解期間的涂層形貌變化來反映。圖5示出PDA-PP在PBS中靜態(tài)浸泡1 d和3 d時的SEM照片?？煽闯?，PDA涂層基本保持完好，無剝落和脫離跡象，基本滿足炎癥反應(yīng)初期的需求[13]。

圖5 降解時間在1 d和3 d時PDA-PP的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of PDA-PP at 1 d (a) and 3 d(b)

2.4 力學(xué)性能分析

采用單向拉伸測試表征PDA涂層對PP補(bǔ)片力學(xué)性能的影響。表1示出PP和PDA-PP的力學(xué)性能比較?？煽闯觯邤?shù)值接近，且無顯著差異，說明PDA涂層不會對PP補(bǔ)片的力學(xué)性能造成影響。

表1 PP和PDA-PP的力學(xué)性能指標(biāo)Tab.1 Mechanical properties of PP and PDA-PP

2.5 體外抗氧化性

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PDA已成功沉積于PP表面，形成了顆粒狀的改性層，在探究PDA是否能夠發(fā)揮抑炎作用之前，首先對PDA-PP的抗氧化性予以探究。測試結(jié)果表明：PP補(bǔ)片無抗氧化性，相同情況下PDA-PP補(bǔ)片對應(yīng)的初始抗氧化能力相當(dāng)于(1.54±0.25) mmol/L FeSO4/cm2溶液的抗氧化性；表明PDA-PP具有顯著的抗氧化性。同時，為進(jìn)一步考察涂層的抗氧化能力，PDA-PP隨即被浸漬于PBS溶液中24 h，經(jīng)分析盡管其抗氧化性較初始值降低了35%，但仍接近于1 mmol/L FeSO4/cm2溶液的抗氧化性，有望滿足調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)初期的應(yīng)用需求。其抗氧化性降低的原因可能是當(dāng)PDA處于含氧和鹽的溶液環(huán)境時，適宜的溫度可使多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化[14]。

2.6 體外炎性反應(yīng)

表2示出不同培養(yǎng)條件下小鼠成纖維細(xì)胞在24 h時的CCK-8吸光度值。通過相對細(xì)胞活力公式計(jì)算可知，與PDA-PP共培養(yǎng)的L929的相對細(xì)胞活力大于90%，說明PDA-PP無細(xì)胞毒性，對后續(xù)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和炎性因子釋放無不利的干擾。巨噬細(xì)胞黏附在材料上后，會發(fā)生向促炎表型M1的活化，同時釋放TNF-α和IL-6a等炎性因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)加劇。同時也會釋放活性氧以清除異物，但活性氧也會上調(diào)炎性因子的表達(dá)[15-16]。

表2 小鼠成纖維細(xì)胞在24 h的CCK-8吸光度Tab.2 CCK-8 absorbance value of L929 at 24 h

表3示出黏附在不同基底上的小鼠單核巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α和IL-6濃度。可看出，黏附在PDA-PP上的巨噬細(xì)胞比黏附在PP上的巨噬細(xì)胞少釋放了93%的TNF-α(P<0.001)，IL-6幾乎不可測，計(jì)為零，相比黏附在PP上的巨噬細(xì)胞減少釋放了100%(P<0.001)。據(jù)推測，導(dǎo)致炎性因子表達(dá)水平顯著下調(diào)的原因主要是得益于PDA的抗氧化能力，該結(jié)構(gòu)可消除巨噬細(xì)胞釋放的活性氧，從而降低炎性因子的釋放[11]。上述結(jié)果證實(shí)PP表面的PDA涂層具有優(yōu)異的抑炎性能，同時也揭示了采用PDA改性PP用以抑制炎癥反應(yīng)是可行的。

表3 小鼠單核巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度Tab.3 Concentration of TNF-α and IL-6 released from RAW 264.7

3 結(jié) 論

1)通過無毒、快速、簡易的方法將聚多巴胺成功以微納米顆粒的形式沉積改性于聚丙烯表面。通過對表面成分和水接觸角分析可知，PDA涂層顯著改變了聚丙烯表面的理化性能，但未改變補(bǔ)片的力學(xué)性能。

2)聚多巴胺涂層聚丙烯補(bǔ)片具有良好的抗氧化能力和涂層穩(wěn)定性，有利于在炎性反應(yīng)初期發(fā)揮作用。

3)聚多巴胺涂層聚丙烯補(bǔ)片可比聚丙烯補(bǔ)片分別降低93%的TNF-α和100%的IL-6釋放，證明聚多巴胺涂層聚丙烯補(bǔ)片在體外培養(yǎng)的情況下只會引發(fā)極低的炎性反應(yīng)，展現(xiàn)出了良好的臨床應(yīng)用價值與前景。